腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

孫海燕,孔德庸,胡慧影,杜丹鳳,馬傳芳,郭 偉,*

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院,大慶 163319 2 黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗室,大慶 163319

黑龍江省作為全國重要商品糧基地,玉米是其種植面積最大的作物。該地區(qū)作為典型的一年一熟制春玉米生產(chǎn)區(qū)域,多在4月下旬開始播種,苗期氣溫頻繁波動,低溫冷害(甚至“倒春寒”)作為該地區(qū)主要農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害[1-2],已成為導(dǎo)致玉米產(chǎn)量不穩(wěn)、品質(zhì)不高的主要原因[3]。低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧損傷膜的結(jié)構(gòu)[4],而植物對低溫的最初響應(yīng)就是調(diào)整生物膜本身的膜脂不飽和度及改善低溫下膜的流動性[5-6],以增強(qiáng)植物抗氧化應(yīng)激能力?？寡趸芰Φ膹?qiáng)弱是由系列小分子物質(zhì)含量和抗氧化酶活性決定的[7],如超氧化物歧化酶(SOD,superoxide dismutase)、過氧化物酶(POD,peroxidase)、過氧化氫酶(CAT,catalase)和抗壞血酸過氧化物酶(APX,ascorbate peroxidase)等。超氧自由基(SAR,superoxide anion radical)在SOD作用下轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2,hydrogen peroxide),進(jìn)而在CAT、POD或抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH,ascorbic acid-reduced glutathione)循環(huán)系統(tǒng)的作用下分解為H2O[4]。同時,抗壞血酸(AsA,ascorbic acid)、谷胱甘肽(GSH,reduced glutathione)、維生素E和類胡蘿卜素等低分子量抗氧化劑[8],也可直接與SAR、分子單態(tài)氧和羥基自由基相互作用,參與活性氧的非酶清除[9]。低溫是破壞植物代謝過程和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境壓力之一,由于玉米原產(chǎn)于熱帶,對低溫脅迫特別敏感[10]。黑龍江地區(qū)頻發(fā)的低溫冷害具有明顯的區(qū)域性和季節(jié)性特征[2],短時低溫危害對作物生長影響不大,但持續(xù)3 d以上14℃以下的溫度將對玉米產(chǎn)量形成不利影響[11-12]。因此,提高玉米的耐低溫能力,尤其是研究玉米苗期的耐低溫機(jī)制及栽培技術(shù),對提高該地區(qū)玉米生產(chǎn)能力具有重要的意義[13]。盡管有大量的工作致力于低溫脅迫下玉米細(xì)胞中低分子量抗氧化劑和抗氧化酶作用機(jī)制的研究,但關(guān)于玉米幼苗對低溫的代謝反應(yīng)及系統(tǒng)響應(yīng)研究不多。腐植酸作為一種自然界中廣泛存在的大分子有機(jī)物質(zhì),用其處理作物種子,可以顯著提高作物對非生物脅迫的耐受能力[14]。腐植酸浸種可顯著提高干旱脅迫下谷子的發(fā)芽勢和活力指數(shù),有效緩解干旱脅迫對谷子的傷害[15]；有效提高小麥葉片GSH含量、SOD和CAT活性[16]；促進(jìn)可溶性糖積累,提高根系滲透性,有效緩解鹽堿脅迫對小麥幼苗的質(zhì)膜損傷[17]。葉片外源施用腐植酸[18-19]或與化肥一起根際施用[20]也可提高抗氧化酶活性,增加游離脯氨酸含量[19],減緩葉綠素分解[18],增強(qiáng)根系活力[20],提高作物的抗旱性。因此,本文在前期研究基礎(chǔ)上[16-17],參考腐植酸處理玉米種子方法[21],研究了15℃/8℃的低溫脅迫下玉米幼苗的代謝活性、系統(tǒng)抗性和抗氧化能力,以明確腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗的耐逆生理機(jī)制及適宜濃度,為黑龍江省玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)栽培技術(shù)研究與應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用玉米(ZeamaysL.)品種為鄭單958。腐植酸(C9H9NO6,分子量227.16)由四川西亞化工股份有限公司制造。

1.2 研究方法

選取籽粒飽滿、均勻一致的玉米種子,用2%次氯酸鈉溶液消毒種子30 min,蒸餾水反復(fù)沖洗干凈,用濾紙將表面水分吸干。然后分別用質(zhì)量濃度為0(蒸餾水)、0.2%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%的腐植酸溶液在室溫條件下浸種12 h,用蒸餾水將種子沖洗干凈,將其分別整齊擺放在鋪有雙層濾紙的發(fā)芽盒中,在溫度為20℃、相對濕度為70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,期間根據(jù)濾紙濕度情況及時補(bǔ)充蒸餾水。7 d后選取整齊一致的幼苗移植于帶有圓孔的泡沫板上(10株/盒),在塑料方盒(30 cm×50 cm)中用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)條件為光照度100 μmol m-2s-1,溫度20℃,光周期12 h/12 h,每3 d更換1次營養(yǎng)液,待玉米幼苗第3片葉完全展開后進(jìn)行低溫脅迫。將不同濃度浸種處理的幼苗在晝夜溫度為15℃/8℃下進(jìn)行低溫脅迫培養(yǎng),每個處理重復(fù)3次,脅迫培養(yǎng)48 h后取樣測定。

每個處理選取整齊一致的8株幼苗,將幼苗分為根系與地上兩部分,用濾紙吸干表面水分,然后用電子天平(精度0.01 g)分別測定根系和地上部8株總鮮重,根系鮮重與地上部分鮮重比值即為根冠比。測定后迅速用液氮冷凍并置于-80℃冰箱保存。分別參照劉萍等[22]的方法采用氯化硝基四氮唑藍(lán)光還原法測定SOD活性；采用紫外吸收法測定CAT活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法測定POD活性；采用羥胺氧化法測定SAR產(chǎn)生速率；采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛(MDA,malondialdehyde)含量；采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白質(zhì)(SP,soluble protein)含量；采用蒽酮比色法測定可溶性糖(SS,soluble sugar)含量；采用2,6-二氯酚靛酚法測定AsA、脫氫抗壞血酸(DHAA,dehydroascorbic acid)含量；采用二硫代(2-二硝基苯甲酸)法測定GSH、氧化型谷胱甘肽(GSSG,oxidized glutathione)含量；采用分光光度法測定APX活性；采用氯化三苯基四氮唑法測定根系活力。參照中國科學(xué)院上海植物生理研究所[23]的方法采用分光光度法測定苯丙氨酸解氨酶(PAL,phenylalnine ammonia-lyase)、多酚氧化酶(PPO,polyphenol oxidase)活性及H2O2含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用WPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖,SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米植株代謝活性與鮮重的影響

由圖1可知,隨著腐植酸浸種濃度的增加,低溫脅迫下玉米單株鮮重和根冠比呈單峰曲線,峰值出現(xiàn)在0.4%的處理濃度。其中,0.2%—0.8%腐植酸浸種處理的單株鮮重較對照顯著增加了31.9%—40.8%,腐植酸浸種濃度≥1.2%處理的單株鮮重與對照間無顯著差異；根冠比顯著高于對照41.8%—84.7%。

圖1 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米單株鮮重和根冠比的影響Fig.1 Effects of soaking seed with humic acid on plant fresh weight and root shoot radio of maize seedlings under low temperature stress不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

由圖2可知,地上部和根系鮮重與單株鮮重變化相似,隨著腐植酸浸種濃度的增加,地上部鮮重和根系鮮重也呈單峰曲線,峰值出現(xiàn)在0.4%的處理濃度,但地上部鮮重與對照間無顯著差異；0.2%—1.2%處理的根系鮮重較對照顯著增加了38.7%—105.3%。因此,腐植酸浸種主要促進(jìn)了低溫脅迫下玉米幼苗根系的生長,從而增加了植株的鮮重,但腐植酸處理濃度≥1.2%則抑制地上部生長,且對根系生長的促進(jìn)作用也減弱。

圖2 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗地上部鮮重和根系鮮重的影響Fig.2 Effects of soaking seed with humic acid on fresh weight of shoot and root in maize seedlings under low temperature stress

由圖3可知,低溫條件下腐植酸浸種促進(jìn)幼苗生長的主要途徑是提高了植株的氮代謝水平,而對碳代謝影響不顯著(圖4)。隨著浸種濃度的增加,葉片和根系的可溶性蛋白含量呈單峰曲線,峰值分別出現(xiàn)在1.2%和1.6%的濃度處理；0.4%—2.0%濃度處理的葉片可溶性蛋白含量顯著高于對照23.3%—34.9%；0.8%—2.0%濃度處理的根系可溶性蛋白含量高于對照31.9%—89.6%。由此可知,葉片的可溶性蛋白積累對腐植酸浸種處理的響應(yīng)時間早于根系,但響應(yīng)程度小于根系。腐植酸浸種處理的葉片和根系可溶性糖的含量與對照間無顯著差異。

圖3 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of soaking seed with humic acid on soluable protein content in maize seedlings under low temperature stress

圖4 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of soaking seed with humic acid on soluable sugar content in maize seedlings under low temperature stress

2.2 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗根系活力與系統(tǒng)抗性的影響

低溫條件下腐植酸浸種可不同程度的增強(qiáng)植株對脅迫的系統(tǒng)響應(yīng),主要表現(xiàn)為系統(tǒng)抗性的代表性酶PAL、PPO活性及根系活力的提高。由圖5可知,低溫脅迫條件下腐植酸浸種處理的葉片和根系的PAL活性均不同程度的增強(qiáng),在1.6%濃度處理出現(xiàn)PAL峰值,分別較對照顯著增加了16.8%和38.8%,且各濃度處理下根系的PAL活性增加的幅度大于葉片各相同處理。

圖5 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響Fig.5 Effects of soaking seed with humic acid on phenylalnine ammonialyase activity in maize seedlings under low temperature stress

低溫脅迫條件下腐植酸浸種對玉米植株P(guān)PO活性的影響與PAL相似(圖6),不同的是葉片的PPO活性峰值出現(xiàn)在1.6%濃度處理,較對照顯著增加了27.7%,而根系的PPO活性峰值出現(xiàn)在2.0%濃度處理,較對照顯著增加了23.4%,當(dāng)浸種濃度≤0.4%,根系PPO活性增加的幅度大于葉片,而處理濃度>0.4%時,PPO活性增加幅度小于葉片。

圖6 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗多酚氧化酶(PPO)活性的影響Fig.6 Effects of soaking seed with humic acid on polyphenol oxidase activity in maize seedlings under low temperature stress

當(dāng)腐植酸浸種濃度為1.6%時,PAL和PPO活性顯著增加,而根系活力隨著濃度的增加呈單峰曲線(圖7),其中,0.4%和0.8%濃度處理的根系活力最高,較對照分別顯著提高了25.1%和25.0%。綜合根系的鮮重、根冠比及植株蛋白質(zhì)含量的變化分析可知,低濃度浸種促進(jìn)了根系的生長,且隨著濃度的增加對根系發(fā)育的影響減弱,但逐步增強(qiáng)了植株的系統(tǒng)抗性。

圖7 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗根系活力的影響Fig.7 Effects of soaking seed with humic acid on root activity in maize seedlings under low temperature stress

2.3 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米植株抗氧化特性的影響

由表1可知,隨著腐植酸浸種濃度的增加,玉米幼苗葉片SAR呈現(xiàn)不同程度的降低,其中1.6%和2.0%濃度處理的SAR較對照分別顯著降低了24.3%和23.0%,而根系SAR與對照間無顯著差異。SOD作為受超氧自由基誘導(dǎo)的抗氧化酶,其活性受浸種濃度影響較小,只有2.0%濃度處理的葉片SOD活性較對照顯著降低了64.8%,其他處理葉片與根系的SOD活性與對照間無顯著差異。

表1 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米氧化特性及抗氧化酶活性的影響

超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)后生成的過氧化物進(jìn)一步誘導(dǎo)抗氧化酶活性的增強(qiáng),腐植酸浸種處理下葉片和根系的CAT活性呈單峰曲線,其中0.4%和0.8%濃度處理的葉片CAT活性較對照分別增加了101.7%和66.4%；0.8%和1.2%濃度處理的根系CAT活性較對照分別增加了108.1%和98.5%。隨著浸種濃度的增加,葉片POD活性呈單峰曲線,但與對照間無顯著差異；根系POD活性與對照間無顯著差異。

腐植酸浸種處理的葉片H2O2含量顯著低于對照18.7%—37.6%,根系H2O2含量顯著低于對照27.5%—49.7%,且低濃度處理葉片H2O2含量大于高濃度處理,而低濃度處理根系H2O2含量小于高濃度處理。結(jié)合POD、CAT活性變化可得到,H2O2可能是低溫脅迫下積累的過氧化物的主要成分。

由GSH-AsA循環(huán)(表2)可知,隨著腐植酸浸種濃度的增加,葉片的GSH含量逐漸增加,而根系的GSH含量呈單峰曲線,隨著浸種濃度的增加,葉片GSSG含量呈單峰曲線,僅0.8%濃度處理的GSSG含量較對照顯著增加了25.4%,而各處理的根系GSSG含量與對照間無顯著差異。

表2 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)活性的影響

隨著腐植酸浸種濃度的增加,葉片AsA含量呈單峰曲線,峰值出現(xiàn)在1.6%的處理濃度,其中1.2%和1.6%處理濃度的葉片AsA含量較對照分別增加了37.4%和62.6%；而根系的AsA含量隨處理濃度的增加逐漸增加,當(dāng)處理濃度≥1.2%時,AsA含量顯著增加了40.4%—58.6%。隨著浸種濃度的增加,葉片和根系的DHAA含量逐漸增加,其中1.6%和2.0%濃度處理的葉片DHAA含量分別增加了31.9%和36.2%；當(dāng)處理濃度≥1.2%時,DHAA含量顯著增加了47.9%—70.3%。由此可知,腐植酸浸種主要促進(jìn)了DHAA形成,提高了GSH-AsA循環(huán)活性。

隨著腐植酸浸種濃度的增加,葉片APX活性呈單峰曲線,其中0.8%和1.2%濃度處理的葉片APX活性較對照分別顯著提高了72.3%和97.9%,其他處理的葉片APX活性與對照相比差異不顯著；根系A(chǔ)PX活性隨著腐植酸浸種濃度的增加逐漸增加,當(dāng)處理濃度超過1.6%,APX活性降低,但其他處理的酶活性均顯著低于對照(1.2%和1.6%濃度處理除外)。

MDA是膜脂過氧化程度的重要衡量指標(biāo),腐植酸浸種處理的葉片MDA含量較對照降低了3.0%—30.0%(圖8),其中0.8%—1.6%濃度處理的MDA含量顯著降低了22.0%—30.0%；根系MDA含量較對照降低了1.6%—45.7%,其中0.2%、0.4%和0.8%濃度處理的根系MDA含量分別顯著降低了37.1%、45.7%和28.0%,且明顯低于相同處理的葉片,而濃度處理≥0.8%,根系與葉片MDA含量與對照相近。由此可見,低濃度(0.2%和0.4%)腐植酸浸種處理對低溫脅迫下玉米幼苗的根系抗氧化保護(hù)作用較強(qiáng),中等濃度(0.8%和1.2%)浸種處理對根系的保護(hù)作用減弱,對葉片的抗氧化保護(hù)加強(qiáng),高濃度(1.6%和2.0%)浸種對幼苗的抗氧化能力影響較小。

圖8 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗丙二醛含量的影響Fig.8 Effects of soaking seed with humic acid on malondialdehyde content in maize seedlings under low temperature stress

2.4 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米植株代謝、抗氧化特性及系統(tǒng)抗性間相關(guān)分析

由表3可知,低溫脅迫和腐植酸浸種處理下幼苗SAR產(chǎn)生速率與SOD活性間顯著正相關(guān)；根系SAR與葉片、根系CAT活性顯著負(fù)相關(guān)；根系H2O2含量與葉片、根系的MDA含量顯著正相關(guān)；葉片的H2O2含量與SOD活性間顯著正相關(guān)。綜合分析,SAR的產(chǎn)生誘導(dǎo)了SOD活性,低溫條件下腐植酸浸種對SAR產(chǎn)生和SOD活性影響不顯著,而CAT活性增強(qiáng),且與SAR呈顯著負(fù)相關(guān),與H2O2含量無顯著相關(guān)性；MDA含量與H2O2含量正相關(guān),與SAR相關(guān)不顯著。可見,低溫脅迫條件下腐植酸浸種可消除H2O2積累,從而降低了膜脂過氧化程度,而依靠CAT活性增強(qiáng)消除H2O2并非主要途徑。

表3 低溫脅迫下玉米抗氧化酶系及膜脂過氧化間相關(guān)分析

由表4可知,葉片SAR產(chǎn)生速率與幼苗的AsA、DHAA、GSH及GSSG等AsA-GSH循環(huán)主要物質(zhì)含量間顯著負(fù)相關(guān)；葉片H2O2含量與AsA-GSH循環(huán)也呈顯著負(fù)相關(guān)；根系的MDA含量與AsA-GSH循環(huán)關(guān)系較為復(fù)雜,主要表現(xiàn)為根系的MDA含量與根系的AsA-GSH循環(huán)正相關(guān),而葉片為負(fù)相關(guān)。由此可知,低溫脅迫條件下腐植酸浸種提高了AsA-GSH循環(huán)強(qiáng)度,加強(qiáng)H2O2的清除,并且是H2O2清除的主要途徑。

表4 低溫脅迫下玉米AsA-GSH循環(huán)及膜脂過氧化間相關(guān)分析

由表5可知,根系活力與根系的H2O2、MDA含量顯著負(fù)相關(guān),與葉片的SOD、CAT活性及根系GSSG含量顯著正相關(guān),與幼苗DHAA含量顯著負(fù)相關(guān)?？梢?低溫脅迫下腐植酸浸種可能是通過加強(qiáng)根系對H2O2的清除能力起到減弱根系的膜脂過氧化程度,從而促進(jìn)根系發(fā)育的一個重要途徑。

表5 低溫脅迫下玉米系統(tǒng)抗性、碳氮代謝與膜脂過氧化間相關(guān)分析

PAL、PPO作為系統(tǒng)抗性的代表性酶,與葉片H2O2含量、根系的SOD活性顯著負(fù)相關(guān),與根系GSH、DHAA含量顯著正相關(guān)。由此可知,低溫脅迫下腐植酸浸種加強(qiáng)了根系A(chǔ)sA-GSH循環(huán),提高了植株對H2O2的系統(tǒng)響應(yīng)。

葉片SS含量與DHAA含量顯著正相關(guān),而與SOD和CAT活性顯著負(fù)相關(guān)；葉片的SP與H2O2含量顯著負(fù)相關(guān),與CAT活性顯著負(fù)相關(guān),而根系的SP與H2O2含量顯著負(fù)相關(guān),與根系的AsA-GSH循環(huán)主要物質(zhì)顯著正相關(guān)?？梢?低溫脅迫下腐植酸浸種加強(qiáng)了幼苗氮代謝,增強(qiáng)了抗氧化酶系活性,從而加強(qiáng)了H2O2的清除能力。

3 討論

3.1 腐植酸浸種處理下玉米幼苗響應(yīng)低溫脅迫的主要誘導(dǎo)因子

植物在不同的非生物脅迫下都可以觀察到膜損傷現(xiàn)象,低溫脅迫首先發(fā)生在細(xì)胞膜系統(tǒng)[24]。研究認(rèn)為,玉米的最佳生長溫度為25—28℃,在12℃以下玉米幼苗的過氧化應(yīng)激基因表達(dá)上調(diào),SOD與APX活性同時提高,降低由活性氧引起的細(xì)胞離子外滲成為提高耐低溫的重要特征[25]。低溫脅迫導(dǎo)致SAR積累,從而誘導(dǎo)SOD活性,轉(zhuǎn)化為高濃度的H2O2,進(jìn)而提高了抗氧化酶系活性。本研究中腐植酸浸種對玉米幼苗抗氧化響應(yīng)的主要誘導(dǎo)因子也是H2O2而非SAR。因為不僅幼苗的SAR產(chǎn)生速率與誘導(dǎo)酶SOD活性間相關(guān)系數(shù)顯著,且系統(tǒng)抗性代表酶PAL、PPO活性及AsA-GSH循環(huán)主要物質(zhì)含量的變化也表現(xiàn)為與H2O2含量的顯著相關(guān)性。這可能是低溫脅迫下活性氧濃度超出一定范圍,易使SOD、POD等酶失活[26]。植物在不適的生長環(huán)境下會產(chǎn)生超過正常水平的活性氧[4],研究發(fā)現(xiàn)在植物中2%左右的基因表達(dá)是受H2O2調(diào)控的[27],尤其是在非生物逆境條件下H2O2可以誘導(dǎo)許多保護(hù)酶編碼基因的產(chǎn)生[28-29],介導(dǎo)了一系列的抗性機(jī)制[30-31]。本文中玉米幼苗葉片和根系的膜脂過氧化的主要產(chǎn)物MDA含量均與根系的H2O2含量顯著正相關(guān),而與SAR產(chǎn)生速率相關(guān)不顯著。綜合分析,腐植酸浸種通過消除根系的H2O2積累,從而減少低溫脅迫對根系的質(zhì)膜損傷,增強(qiáng)玉米幼苗對過氧化的系統(tǒng)響應(yīng)。

3.2 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗H2O2清除的主要途徑

低溫脅迫下SAR和H2O2作為植株體內(nèi)最主要的活性氧導(dǎo)致膜脂過氧化,破壞細(xì)胞膜完整性,激活抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá),增強(qiáng)植株自身活性氧清除能力是植物耐低溫脅迫的主要途徑[32]。鄭春芳等[33]等研究認(rèn)為低溫脅迫下清除葉片H2O2的AsA-GSH循環(huán)受到抑制,致使葉片對活性氧的清除主要依賴SOD。但也有研究表明,由于SOD、POD等酶在低溫條件下受活性氧積累的影響易失去活性和分解[34],同時,CAT對底物H2O2的親和力較低,而AsA-GSH循環(huán)在胞質(zhì)H2O2的清除中起主要作用。本文研究認(rèn)為,由于腐植酸浸種對低溫脅迫下SAR產(chǎn)生速率影響很小,而調(diào)控H2O2的積累是加強(qiáng)玉米幼苗抵御低溫膜質(zhì)過氧化的主要途徑。雖然腐植酸浸種同步提高了CAT和AsA-GSH循環(huán)活性,但H2O2清除主要依靠AsA-GSH循環(huán)。前人研究證實(shí),在AsA-GSH循環(huán)中AsA含量及AsA/DHAA比值與抗冷性呈正相關(guān)[35-36]。此外,GSH作為植物體內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)之一,除了直接參與活性氧的清除,還與AsA偶聯(lián)[37],GSH及GSH/GSSG 比值成為激活植物體內(nèi)抗性基因的信號因子[38]。本研究中腐植酸浸種提高了低溫脅迫下玉米幼苗的GSH、GSSG、AsA和DHAA含量,但GSH和GSSG含量的增加幅度明顯小于AsA和DHAA增加幅度,且浸種處理的葉片APX活性增加幅度均大于50%。由此可見,低溫脅迫下腐植酸浸種加強(qiáng)了AsA和GSH再生,提高了AsA-GSH循環(huán)活性而增加H2O2清除能力,且以促進(jìn)AsA合成為核心。這與低溫脅迫下番茄[39]、黃瓜[40]、秋茄[33]、茶樹[32]的AsA-GSH循環(huán)研究結(jié)果相似。腐植酸浸種增強(qiáng)低溫脅迫下玉米幼苗抗氧化機(jī)制與外源褪黑素的作用途徑一致,外施褪黑素也是通過增加AsA含量,提升AsA/DHAA比值,為APX提供足夠的底物使AsA再生成,促進(jìn)了AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)[33]。

3.3 低溫脅迫下玉米幼苗對腐植酸浸種的系統(tǒng)響應(yīng)

低溫是破壞栽培植物代謝過程和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境壓力之一[10],玉米在低溫(晝夜14℃/12℃)條件下28 h就會發(fā)生冷應(yīng)激反應(yīng),冷敏感型玉米的細(xì)胞滲透電位降低,主要與蔗糖積累降低有關(guān)[41],而耐冷型玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和水孔蛋白含量顯著增加,韌皮部轉(zhuǎn)載蔗糖能力提高[42]。本研究發(fā)現(xiàn)腐植酸浸種處理的玉米幼苗低溫脅迫下可溶性糖含量略有增加,但與對照差異不顯著,而可溶性蛋白質(zhì)含量增加明顯?？扇苄蕴窍蚋档倪\(yùn)輸和積累可提高根系滲透調(diào)節(jié)能力,防止膜脂過氧化,維持根系活力。但本研究中腐植酸浸種降低了植物C/N,通過加強(qiáng)氮代謝,促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)合成,從而提高抗氧化酶系活性,以及GSH等含氮抗氧化物質(zhì)含量以維系質(zhì)膜完整性,保持根系活力；根系活力與抗氧化特性的相關(guān)分析也表明,根系活力與根系的GSSG含量顯著正相關(guān),而與DHAA含量顯著負(fù)相關(guān)。腐植酸浸種不僅提高了低溫脅迫下植株的抗氧化能力,同步誘導(dǎo)了系統(tǒng)抗性的增強(qiáng),而后者的提高又加強(qiáng)了前者的能力,葉片H2O2含量的降低與PAL和PPO活性的增強(qiáng)顯著相關(guān)。腐植酸浸種增強(qiáng)植株對低溫脅迫抗氧化響應(yīng)的重要原因在于其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)。腐植酸作為大分子聚合物,帶有羧基、酚基、酮基等活性基團(tuán),具有很強(qiáng)的生物活性和可變電子價位[43],而這些特性被證明分別是海藻提取物[44]、稀土元素[34]能夠提高低溫條件下玉米抗氧化應(yīng)激能力的原因。

3.4 腐植酸浸種對低溫脅迫下玉米幼苗生長的影響

玉米低溫脅迫下外源脫落酸灌根研究表明,PAL和PPO活性的提升,既提高了幼苗的抗氧化能力,也有利于低溫后的幼苗修復(fù)[45]。本研究發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)抗性和氮代謝的加強(qiáng)是根系和葉片對腐植酸浸種的共同反應(yīng),尤其是PAL活性；浸種處理后根系在SAR和H2O2雙重信號的作用下,抗氧化酶系、AsA-GSH循環(huán)活性均得到加強(qiáng)；而葉片對浸種的響應(yīng)主要是AsA-GSH循環(huán)；腐植酸浸種處理的根系鮮重顯著提高,而對葉片鮮重影響較小。因此,維持根系活力、促進(jìn)根系生長成為腐植酸浸種調(diào)控玉米幼苗耐低溫脅迫的主要途徑。比較不同浸種濃度的效果可知,大多數(shù)測定指標(biāo)均表現(xiàn)為隨浸種濃度的增加呈單峰曲線或?qū)?shù)曲線,其中AsA-GSH循環(huán)主要物質(zhì)含量和酶活性的峰值出現(xiàn)在1.6%或2.0%濃度處理；系統(tǒng)抗性酶活性及SS、SP含量的峰值出現(xiàn)在1.6%濃度處理；但抗氧化酶活性、根系活力和鮮重的峰值出現(xiàn)在0.4%或0.8%濃度處理。而根系的H2O2含量在0.8%濃度處理時達(dá)到最低值,MDA含量在0.4%濃度處理時達(dá)到最低值；同時,葉片的H2O2含量在1.2%濃度處理時達(dá)到最低值,MDA含量在0.8%濃度處理時即達(dá)到最低值。可見,高濃度的腐植酸浸種有利于低溫脅迫下玉米幼苗對活性氧的清除和系統(tǒng)抗性的增強(qiáng),但AsA-GSH循環(huán)主要物質(zhì)和系統(tǒng)抗性酶的合成是以犧牲生長為代價。植物往往以消耗更多的代謝資源用于防御系統(tǒng)的激活以“權(quán)衡生長與防御”[46],但快速生長也是植物耐受逆境的一種重要方式[47]。因此,綜合分析評價膜質(zhì)損傷程度、根系活力和生長質(zhì)量認(rèn)為,用0.4%—0.8%質(zhì)量濃度的腐植酸浸種對提高玉米幼苗耐低溫脅迫較為適宜。前人的研究發(fā)現(xiàn),在土壤中施用不超過1 g/kg的腐植酸類物質(zhì)或葉面噴施0.1%的腐植酸,可促進(jìn)作物生長[48]。本研究中采用0.4%—0.8%的腐植酸浸種可顯著提高玉米耐低溫能力,但試驗是基于人工氣候箱的水培方式進(jìn)行的,對于露地生產(chǎn)的實(shí)踐效果還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低溫脅迫條件下腐植酸浸種主要受到H2O2積累誘導(dǎo),促進(jìn)了可溶性蛋白質(zhì)合成,提高氮代謝水平,以消除根系的H2O2積累,減少低溫脅迫對根系的質(zhì)膜損傷為主要途徑。通過增強(qiáng)CAT活性,促進(jìn)AsA合成為核心,增強(qiáng)AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)活性；提高PAL、PPO活性,增強(qiáng)幼苗系統(tǒng)抗性；維持根系活力和促進(jìn)根系生長來提高玉米植株根冠比,提高玉米幼苗的抗氧化應(yīng)激能力。雖然,質(zhì)量濃度為1.6%—2.0%的腐植酸浸種處理可獲得最好的AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)活性和系統(tǒng)抗性,但是以犧牲生長為代價,在本研究中0.4%—0.8%處理即可達(dá)到最佳的H2O2清除效果,獲得最大的根系活力和鮮重,可作為水培條件下玉米種子處理的適宜濃度。