基于AMPK/mTOR/Akt途徑探究肛門(mén)洗劑促進(jìn)肛瘺大鼠術(shù)后創(chuàng)面愈合的機(jī)制

吳成成 謝昌營(yíng) 羅文兵 肖慧榮

1江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科（南昌330004）；2江西省分宜縣中醫(yī)院肛腸科（江西新余336600）

肛瘺是由于肛周間隙的損傷、感染或是異物等病理因素所形成的與肛周皮膚相通的異常通道，癥狀主要有局部瘙癢、疼痛、流膿等，在我國(guó)，肛瘺的發(fā)病率約占所有肛腸疾病的1.7%～3.9%［1］，且復(fù)發(fā)率較高，對(duì)患者的生活帶來(lái)了很大不便。目前臨床治療肛瘺主要以手術(shù)為主，但是由于手術(shù)方式是開(kāi)放式手術(shù)，創(chuàng)口易被糞便污染，通常不進(jìn)行縫合，因此，減輕肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的炎性反應(yīng)，緩解患者的疼痛，促進(jìn)創(chuàng)面愈合對(duì)于肛瘺術(shù)后恢復(fù)至關(guān)重要［2］。肛門(mén)洗劑是在五倍子湯的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，具有清熱解毒消腫、燥濕止癢止血的功效，在肛瘺、混合痔等術(shù)后廣泛應(yīng)用，療效確切［3-4］。本研究通過(guò)觀察肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺創(chuàng)面修復(fù)的影響，探討肛門(mén)洗劑可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40 只SPF 健康SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，雌雄各半，購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤生物科技公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2018?0012。

1.2 藥物與試劑肛門(mén)洗劑（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，20190604）；高錳酸鉀（正大豐海藥業(yè)，JS030516）；血管生長(zhǎng)因子（vascular growthrelated factors，VEGF）、促血管生成素?Ⅰ（angiopoietin?Ⅰ，Ang?Ⅰ）、促血管生成素?Ⅱ（angiopoietin?Ⅱ，Ang?Ⅱ）；白介素?1β（interleukin?1β，IL?1β），白介素?2（interleukin?2，IL?2）ELISA 試劑盒（中國(guó)欣博盛）；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA 試劑盒（Assay 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、mTOR、Akt、GAPDH 抗體，美國(guó)Proteintech 公司；BCA 蛋白定量試劑盒，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 主要儀器低溫高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；X73 型倒置熒光顯微鏡，日本OLYMOUS 公司；超聲勻漿器，日本SANYO 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO?RAD 公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型制備40 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、肛門(mén)洗劑組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10 只。除正常對(duì)照組外，其余三組參照王琛等［5］方法制作肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型。操作過(guò)程為：大鼠腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉，背部手術(shù)區(qū)備皮，碘伏消毒，于頸后2.5 cm、脊柱旁側(cè)0.5 cm 處用創(chuàng)傷器做一圓形切口，直徑約1 cm，深達(dá)肌層，另在尾骨旁1.5 cm 處再做一相同大小的切口，止血后用彎鉗從一切口入，鈍性分離至另一切口出，引入凡士林紗條，沿紗條注入2 mL 糞水，圓針縫合切口處皮膚，包扎，45 d 后解除，局部超聲檢查及X 線造影顯示均有瘺管形成。

1.4.2 給藥方法正常對(duì)照組不給藥；模型組：用100 mL 生理鹽水擦洗創(chuàng)面10 min，紗布包扎，每日2 次；肛門(mén)洗劑組：1 包肛門(mén)洗劑稀釋4 倍，取100 mL 擦洗創(chuàng)面10 min，紗布包扎，每日2 次；陽(yáng)性對(duì)照組：高錳酸稀釋5 000 倍，取100 mL 擦洗創(chuàng)面10 min，紗布包扎，每日2 次；連續(xù)給藥2 周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 創(chuàng)面愈合率參照潘友珍等［6］方法測(cè)量創(chuàng)傷面積，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。

1.5.2 檢測(cè)創(chuàng)面肉芽組織Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF、PGE2、IL?1β、IL?2 表達(dá)給藥結(jié)束后，取大鼠創(chuàng)面肉芽組織，低溫研磨，加入2 mL 裂解液勻漿，ELISA 法檢測(cè)Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF、PGE2、IL?1β、IL?2 表達(dá)，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.5.3 HE 常規(guī)染色觀察病理改變給藥結(jié)束后，取大鼠創(chuàng)面組織，10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE 染色，觀察大鼠創(chuàng)面組織病理改變。

1.5.4 RT?PCR 法測(cè)定創(chuàng)面肉芽組織AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達(dá)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取胃組織總RNA，照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RT?PCR 引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃45 s，95 ℃15 s，60 ℃40 s，進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)。每組進(jìn)行3 次測(cè)定，取平均值，圖像分析儀掃描凝膠密度，采用2?△△CT法計(jì)算mRNA 表達(dá)水平。

表1 RT?PCR 引物序列表Tab.1 Primer sequence table for RT?PCR

1.5.5 Western blot 檢測(cè)創(chuàng)面肉芽組織AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達(dá)低溫取創(chuàng)面肉芽組織，冷研磨后加入細(xì)胞裂解液，在4 ℃、2 000 r/min 離心15 min，BCA 蛋白定量法測(cè)定上清液蛋白濃度，取待測(cè)樣品100 μg，SDS?PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗AMPK（1∶1 000）、mTOR（1∶500）、Akt（1∶500）、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗滌，ECL 顯影并掃描。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件包，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠創(chuàng)面愈合率的影響肛門(mén)洗劑組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的創(chuàng)面愈合率較模型組大鼠明顯提高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠創(chuàng)面愈合率的影響Tab.2 Effect of anal lotion on wound healing rate in anal fistula rats ±s，%

表2 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠創(chuàng)面愈合率的影響Tab.2 Effect of anal lotion on wound healing rate in anal fistula rats ±s，%

注：與模型組比較，#P ＜0.05

組別模型組肛門(mén)洗劑組陽(yáng)性對(duì)照組創(chuàng)面愈合率11.82±1.25 66.95±7.16#50.13±4.38#

2.2 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠VEGF、Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，肛門(mén)洗劑組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠VEGF、Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ表達(dá)的影響Tab.3 Effect of anal lotion on expression of VEGF，Ang?Ⅰ，Ang?Ⅱin anal fistula rats ±s

表3 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠VEGF、Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ表達(dá)的影響Tab.3 Effect of anal lotion on expression of VEGF，Ang?Ⅰ，Ang?Ⅱin anal fistula rats ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組肛門(mén)洗劑組陽(yáng)性對(duì)照組VEGF（ng/L）264.09±28.4 124.59±9.92*197.34±28.75#173.79±12.71#Ang-Ⅰ（μg/L）15.96±2.31 6.41±0.53*13.52±1.14#12.88±2.07#Ang-Ⅱ（μg/L）1.71±0.11 0.95±0.07*1.54±0.12#1.43±0.13#

2.3 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠PGE2、IL?1β、IL?2 表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠IL?1β、IL?2、PGE2 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，肛門(mén)洗劑組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的IL?1β、IL?2、PGE2 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠PGE2、IL?1β、IL?2 表達(dá)的影響Tab.4 Effect of anal lotion on expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats ±s

表4 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠PGE2、IL?1β、IL?2 表達(dá)的影響Tab.4 Effect of anal lotion on expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組肛門(mén)洗劑組陽(yáng)性對(duì)照組IL?1β（pg/mL）84.97±7.65 198.08±21.36*104.30±9.58#126.89±14.24#IL?2（pg/mL）115.72±12.79 238.21±20.85*123.83±11.93#157.93±15.27#PGE2（pg/mL）87.49±7.75 426.91±33.96*136.99±14.71#166.75±15.66#

2.4 HE 常規(guī)染色觀察病理改變模型組大鼠創(chuàng)面表層出現(xiàn)明顯出血及壞死，組織高度水腫，伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞分布散亂稀疏，未見(jiàn)新生毛細(xì)血管。肛門(mén)洗劑組、陽(yáng)性對(duì)照組有新生表皮爬覆，炎性浸潤(rùn)明顯減少，成纖維細(xì)胞成熟且分布整齊，膠原纖維致密且排列整齊，可見(jiàn)新生毛細(xì)血管分布。見(jiàn)圖1。

圖1 創(chuàng)面組織病理形態(tài)（HE，×200）Fig.1 Histopathological morphology of the wound（HE，×200）

2.5 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，肛門(mén)洗劑組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt mRNA 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of anal lotion on mRNA expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats

2.6 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，肛門(mén)洗劑組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 肛門(mén)洗劑對(duì)肛瘺大鼠AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of anal lotion on protein expression of PGE2，IL?1β，IL?2 in anal fistula rats

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為肛瘺是由于肛周氣血不暢、濕熱聚結(jié)、邪氣留滯所致。雖可通過(guò)手術(shù)切除，但術(shù)后創(chuàng)面局部濕熱未盡，加之手術(shù)使肛周血脈、經(jīng)絡(luò)受損，從而導(dǎo)致創(chuàng)面氣血虧虛，后期愈合不良［7-10］。因此，肛瘺術(shù)后治療應(yīng)堅(jiān)持清熱燥濕、補(bǔ)氣活血化瘀的治療原則。肛門(mén)洗劑由五倍子、苦參、白芨、桑寄生、明礬、芒硝、黃柏、荊芥等中藥組成，具有燥濕止癢止血、清熱解毒消腫的功效，在臨床治療肛瘺、痔等肛周疾病廣泛使用，可以有效改善患者臨床癥狀、促進(jìn)創(chuàng)面愈合［11］。

炎癥與創(chuàng)面血液運(yùn)行是影響肛瘺創(chuàng)面愈合的重要因素［12-13］，所以減輕創(chuàng)面早期炎癥反應(yīng)，促進(jìn)局部血液循環(huán)，對(duì)于提高肛瘺術(shù)后創(chuàng)口的愈合至關(guān)重要［14］。VEGF 是主要的血管生長(zhǎng)因子，血管生成可謂創(chuàng)面愈合中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究［15］表明慢性傷中VEGF 濃度下調(diào)導(dǎo)致的血管生成減少是傷口難愈合的主要原因；Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ已被公認(rèn)在創(chuàng)傷后病理性血管生成、修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16-17］。PGE2 是重要的炎性介質(zhì)，在局部發(fā)生傷害性刺激時(shí)迅速產(chǎn)生，可以激活周?chē)杏X(jué)神經(jīng)末梢的疼痛受體，強(qiáng)化痛感［18］；IL?2 可以促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)抗體分泌和B 細(xì)胞增殖，激活巨噬細(xì)胞［19］；IL?lβ 在急性炎癥中起重要作用，可激活巨噬細(xì)胞，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，在肛瘺模型大鼠中，肉芽組織Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF表達(dá)降低，說(shuō)明大鼠血運(yùn)不暢，血管生成受損；PGE2、IL?1β、IL?2 表達(dá)升高，說(shuō)明大鼠具有明顯的炎癥反應(yīng)；在經(jīng)過(guò)肛門(mén)洗劑治療后，Ang?Ⅰ、Ang?Ⅱ、VEGF 表達(dá)升高，PGE2、IL?1β、IL?2 表達(dá)降低，說(shuō)明肛門(mén)洗劑可以降低肛瘺大鼠創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面新生血管的形成，從而達(dá)到加速創(chuàng)口愈合，并可能通過(guò)降低PGE2 表達(dá)發(fā)揮一定的鎮(zhèn)痛作用。

AMPK 是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵分子，近年來(lái)的研究顯示AMPK 對(duì)炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用［21］，活化的AMPK 對(duì)多種細(xì)胞中促炎因子（IL?6、IL?1β）的合成及分泌具有抑制作用［22］；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是維持細(xì)胞生長(zhǎng)、新陳代謝以及血管發(fā)生的重要調(diào)控元件。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中可分泌VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等多種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合［23］。Akt 是PI3K/Akt 信號(hào)通路下游重要的靶因子，具有促進(jìn)細(xì)胞生存、抗氧化、抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)功能。研究顯示，增加Akt的表達(dá)量，可促進(jìn)神經(jīng)元存活。本研究對(duì)創(chuàng)口新生肉芽組中AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示模型組大鼠創(chuàng)面AMPK、p?mTOR、p?Akt 蛋白表達(dá)明顯降低；而經(jīng)肛門(mén)洗劑治療后，AMPK、mTOR、Akt 蛋白表達(dá)明顯升高。說(shuō)明肛門(mén)洗劑可通過(guò)激活A(yù)MPK 蛋白表達(dá)抑制創(chuàng)口炎癥反應(yīng)，并可通過(guò)增加mTOR、Akt 蛋白的表達(dá)促進(jìn)創(chuàng)口處細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，加速傷口的愈合。

綜上所述，肛門(mén)洗劑可抑制肛瘺大鼠創(chuàng)口炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管新生及傷口愈合，其可能是通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR/Akt 信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。