醬肉防腐工藝優(yōu)化及其貨架期預(yù)測

袁先鈴，陳崇艷，彭先杰，袁玉梅，張 婷

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

醬肉是將豬后腿肉用甜面醬、香辛調(diào)味料腌制后經(jīng)自然風(fēng)干而成的一類腌臘肉制品，具有色澤美觀、風(fēng)味濃郁的特點，因其獨有的風(fēng)味和口感受到越來越多消費者的青睞。醬肉生產(chǎn)加工過程中主要以添加亞硝酸鹽的方法對其進行護色和防腐。硝酸鹽或亞硝酸鹽是肉制品加工中應(yīng)用歷史最長、范圍最廣的食品添加劑之一。這類食品添加劑價格低廉，不僅可通過發(fā)色作用賦予肉制品良好的外觀色澤，增強肉制品腌制風(fēng)味，延緩脂肪氧化酸敗，還可抑制腐敗菌生長繁殖，延長肉制品貨架期，能有效防止致病菌（特別是肉毒桿菌、沙門氏菌）導(dǎo)致的食物中毒，受到生產(chǎn)者的歡迎。但是自上世紀70年代早期，人們認識到亞硝酸鹽能與肉制品中的氨基酸反應(yīng)生成亞硝胺類化合物（N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基二甲胺等），這類化合物是強致癌物。除此之外，亞硝酸鹽被食用后在人體內(nèi)胃中還可以形成亞硝胺[1]，這在一定程度上給消費者的身體健康埋下了隱患?？刂剖称分衼喯跛猁}使用及殘留量成為普遍關(guān)注的問題，因此醬肉制品低硝化或無硝化是實現(xiàn)醬肉健康持續(xù)發(fā)展的必然趨勢[2-6]。

針對肉類防腐，目前市場上已有較多的復(fù)配型肉制品保鮮劑，很多學(xué)者也在研究用幾種天然或者非天然的食品防腐劑來完全或者部分替代亞硝酸鹽[7-8]。徐海祥等[9]經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，使用乳酸鏈球菌素部分替代亞硝酸鹽，細菌生長繁殖得到顯著抑制，可大幅延長產(chǎn)品的貨架期。Thippareddi等[10]經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，乳酸鹽可控制火雞肉中莢膜芽孢桿菌的數(shù)量。Zhang等[11]通過向牦牛肉糜中添加3種不同種類的乳酸鹽替代亞硝酸鹽，結(jié)果表明，乳酸鹽可顯著提高肉色的穩(wěn)定性。Vareltzis等[12]測試結(jié)果顯示，在4℃和20℃條件下，甜菜堿/山梨酸鉀體系對芽孢桿菌的生長比傳統(tǒng)亞硝酸鹽體系有更好的抑制作用。本試驗通過測定Nisin、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉4種防腐劑對醬肉的菌落總數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮含量的影響，結(jié)合正交試驗探究最佳防腐劑復(fù)配效果，從而達到降低亞硝酸鹽使用量及殘留量、延長貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

豬后腿肉、甜面醬、食鹽、曲酒、白砂糖、花椒面，均購于四川省自貢市沃爾瑪超市。

Nisin、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉、亞硝酸鈉、D-異抗壞血酸鈉，均為食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GZ-250-S低溫生化培養(yǎng)箱：上海AL5O設(shè)備有限公司；BagMixer均質(zhì)機：法國Interscience公司；DZQ-5002SB型真空包裝機：上海圣松有限公司；WFJ7200可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SKY-2102C搖床：上海珂準儀器有限公司；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 川味醬肉配方

川味醬肉的工藝配方為（以鮮肉百分含量計）：肥瘦質(zhì)量比約為3∶7、食鹽4%、曲酒0.5%、白砂糖1%、花椒面0.3%、甜面醬9%。

1.2.2 工藝流程

1.2.3 操作要點

選擇帶皮豬后腿肉，切成厚度2～3 cm，重約300 g小長條；用無菌水清洗肉塊，去除肉表面淤血、豬毛等雜物，晾干；將配料及防腐劑均勻涂抹在肉的表面，保鮮袋封口放入7℃冰箱中腌制4 d，期間上下翻動3次，促使腌制均勻；將肉掛于溫度10℃、相對濕度40%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，待表面微干，上面醬，當醬半干時，重復(fù)上述步驟兩遍，待上醬完成后置于培養(yǎng)箱中3 d。再經(jīng)過常溫風(fēng)干12 h，當醬肉表面不再出現(xiàn)大的水珠時50℃干燥11 h；將制作好的醬肉進行真空包裝，23℃下保存待用。

1.2.4 測定項目與方法

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）：采用GB5009.228—2016[13]中的方法測定；菌落總數(shù)：按照GB4789.2—2016[14]中的方法測定；亞硝酸鹽殘留量：按照GB 5009.33—2016[15]中的鹽酸萘乙二胺法測定；貨架期：結(jié)合ALST法[16]預(yù)測。

1.2.5 試驗方案設(shè)計

1.2.5.1 單因素試驗設(shè)計

在醬肉腌制時期分別添加山梨酸鉀、Nisin、乳酸鈉、雙乙酸鈉等防腐劑，確定各個防腐劑單一濃度變量對醬肉防腐效果的影響,添加量均在食品添加劑使用標準（GB 2760—2014[17]）范圍內(nèi)，如表1所示。在每組醬肉中添加0.04 g/kg的亞硝酸鹽作為護色劑，添加0.7 g/kg的D-異抗壞血酸作為助色劑[12]。在醬肉制作好開始計時，在添加不同防腐劑的情況下，以0、3、6、13、20、27 d為檢測時間點測定菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量和亞硝酸鹽含量等指標[5,18-20]。

1.2.5.2 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗確定防腐劑最佳用量范圍，設(shè)計四因素三水平正交試驗，選取防腐劑最佳復(fù)配比。在醬肉制作好開始計時，分別測定0、3、6、13、20、27 d菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量和亞硝酸鹽含量等指標。

1.2.5.3 貨架期預(yù)測方法

研究采用Q10法進行預(yù)測，設(shè)置差值為10℃的兩個溫度進行儲藏，則兩個溫度下的貨架壽命比率Q10的計算公式見式（1），再根據(jù)式（2）即可得到醬肉在7℃、23℃下儲藏的貨架期[16]。

式（2）中，QS(t)為t℃下的貨架期，QS(t0)為t0℃下的貨架期。

將包裝好的醬肉分別置于27℃和37℃溫度下的恒溫箱內(nèi)。每天取37℃恒溫箱內(nèi)的醬肉測其菌落總數(shù)；每3 d取27℃恒溫箱中醬肉測其菌落總數(shù)。根據(jù)GB 2730—2015[21]菌落總數(shù)為80 000 CFU/g作為醬肉變質(zhì)的終點，測得醬肉在兩種情況下的貨架期。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，將各個指標用SPSS進行方差分析（ANOVA），用多重比較法分析差異顯著性，其中P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山梨酸鉀對醬肉的防腐效果

山梨酸鉀對肉制品有較明顯的防腐作用[20]，由圖1可知，隨著儲藏時間的增加，菌落總數(shù)總體呈現(xiàn)上升的趨勢，在0～6 d時菌落總數(shù)增加明顯，之后菌落總數(shù)的增加趨勢變緩，在27 d時，山梨酸鉀添加量為0.70、1.05、1.40 g/kg的菌落總數(shù)水平在104～105CFU/g，添加量為0.35、0.70 g/kg兩組的菌落總數(shù)差值最大，說明在此濃度范圍的山梨酸鉀對菌落總數(shù)的影響最大。由圖2可知，隨著儲藏時間的增加，揮發(fā)性鹽基氮含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢，0 d時揮發(fā)性鹽基氮含量約13 mg/100 g，在儲藏后期（20～27 d）時，山梨酸鉀添加量為0.70 g/kg時揮發(fā)性鹽基氮增長較其他組緩慢，且最終揮發(fā)性鹽基氮與添加量0.35 g/kg的含量相差很小。選取0.35～0.70 g/kg濃度范圍的山梨酸鉀進行正交試驗。

圖1 山梨酸鉀添加量對醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of potassiumsorbate additionson the total numbers of coloniesin sauced meat

圖2 山梨酸鉀添加量對醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.2 Effects of potassiumsorbateadditionson TVB-Ncontents in sauced meat

2.2 Nisin對醬肉防腐效果的影響

Nisin對肉制品有較明顯的防腐作用[22-24]，由圖3可知，隨儲藏時間的增加，菌落總數(shù)總體呈上升趨勢，在0～6 d時菌落總數(shù)增加很明顯，之后菌落總數(shù)的增加趨勢減緩。在27 d時，Nisin添加量為0.09 g/kg組菌落總數(shù)最多，超過了106CFU/g，說明在此濃度下Nisin對醬肉的防腐效果不理想，其余幾組菌落總數(shù)相對較少（105CFU/g左右）。添加量為0.35 g/kg時菌落總數(shù)與添加量為0.18、0.27 g/kg相差較小，按照添加劑最小原則，選取Nisin添加量范圍為0.18～0.27 g/kg進行正交試驗。由圖4可知，揮發(fā)性鹽基氮含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢，但是與對照組相比，不同的Nisin添加量對揮發(fā)性鹽基氮含量影響不大。0 d時的揮發(fā)性鹽基氮含量在13 mg/100 g左右，27 d時揮發(fā)性鹽基氮含量上升到31 mg/100 g。因此，依照菌落總數(shù)指標，選取Nisin添加量范圍為0.18～0.27 g/kg進行正交試驗。

圖3 Nisin添加量對醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.3 Effects of Nisin additionson thetotal numbers of coloniesin sauced meat

圖4 Nisin添加量對醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.4 Effects of Nisin additionson TVB-Ncontents in sauced meat

2.3 雙乙酸鈉對醬肉防腐效果的影響

雙乙酸鈉對肉制品有較明顯的防腐作用[20,25]，由圖5可知，雙乙酸鈉添加量1.10 g/kg與1.65 g/kg組醬肉菌落總數(shù)相差較大，說明此濃度范圍對菌落總數(shù)影響最大。由圖6可知，試驗組揮發(fā)性鹽基氮的含量均高于對照組，雙乙酸鈉添加量對揮發(fā)性鹽基氮含量影響不明顯，其添加量在1.65 g/kg時揮發(fā)性鹽基氮含量最低，因此將此添加量作為最適添加量的參考。綜合分析，選取1.10～1.65 g/kg濃度范圍的雙乙酸鈉進行正交試驗。

圖5 雙乙酸鈉添加量對醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effects of sodiumdiacetateadditionson thetotal numbers of coloniesin sauced meat

圖6 雙乙酸鈉添加量對醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.6 Effects of sodiumdiacetateadditions on TVB-Ncontentsin sauced meat

2.4 乳酸鈉對醬肉防腐效果的影響

乳酸鈉對肉制品有較明顯的防腐作用[26]，由圖7可知，在乳酸鈉添加量為10～20 g/kg時，菌落總數(shù)的差值最大，說明乳酸鈉在此濃度范圍對醬肉的菌落總數(shù)影響最大。由圖8可知，27 d時乳酸鈉添加量為30 g/kg和20 g/kg的醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量接近，故可選擇20 g/kg乳酸鈉作為最佳添加量。綜合分析，選取10～20 g/kg濃度范圍的乳酸鈉進行正交試驗。

圖7 乳酸鈉添加量對醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effects of sodiumdiacetateadditionson thetotal numbers of coloniesin sauced meat

圖8 乳酸鈉添加量對醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.8 Effects of sodiumlactate additions on TVB-Ncontentsin sauced meat

2.5 正交試驗結(jié)果

復(fù)合防腐劑對肉類防腐有顯著優(yōu)勢[27-29]，根據(jù)正交試驗設(shè)計表，測定不同處理組的菌落總數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮含量，計算各組指標及平均值，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2可知，就菌落總數(shù)而言，根據(jù)極差分析，各防腐劑對醬肉防腐效果影響次序為：山梨酸鉀＞乳酸鈉＞Nisin＞雙乙酸鈉，最優(yōu)復(fù)配組合為A3B3C2D3，即各個防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.22 g/kg、雙乙酸鈉1.40 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。各防腐劑對醬肉揮發(fā)性鹽基氮生成影響次序為：山梨酸鉀＞雙乙酸鈉＞Nisin＞乳酸鈉，最優(yōu)復(fù)配組合為A3B3C3D3，即各個防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.22 g/kg、雙乙酸鈉1.65 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

綜上所述，這幾種防腐劑對菌落總數(shù)的影響較大，對揮發(fā)性鹽基氮的影響較小，最優(yōu)配比可以依照菌落總數(shù)的最優(yōu)配比來選擇，但是在GB2760—2014[17]添加劑使用原則中提及各防腐劑的用量占其最大用量的比列和不應(yīng)超過1，而以上兩個最優(yōu)復(fù)配組合比例和都大于1，就實際生產(chǎn)而言是無意義的。根據(jù)主次影響因素，主要因素是山梨酸鉀，次要因素是乳酸鈉，然后才是Nisin和雙乙酸鈉，可將主要因素和次要因素選擇為A3D3，另外兩個添加劑選定為B1C1，即最優(yōu)組合為A3B1C1D3，此時各個防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.18 g/kg、雙乙酸鈉1.15 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。

根據(jù)正交試驗結(jié)果，按照A3B1C1D3最優(yōu)復(fù)配添加量制作醬肉并測其揮發(fā)性鹽基氮和菌落總數(shù)，27 d時菌落總數(shù)為2.37×104CFU/g，與正交試驗第7組的菌落總數(shù)相近；27 d時揮發(fā)性鹽基氮含量為34.88 mg/100 g，比正交試驗第8組減小了0.38 mg/100 g，防腐效果較好。此時亞硝酸鹽殘留量為3.15 mg/kg，與對照組相比降低了6.55 mg/kg，達到了降低亞硝酸鹽殘留量的目的。

2.6 亞硝酸鹽殘留量分析

選取單因素中最優(yōu)添加量測定亞硝酸鹽殘留量，結(jié)果如圖9所示。

圖9 亞硝酸鹽殘留量的測定Fig.9 Determination of nitrite residue

由圖9可知，在不影響對醬肉的防腐情況下，4種防腐劑按最優(yōu)添加量加入，能明顯降低亞硝酸鹽的殘留量，達到預(yù)期的試驗?zāi)康摹?/p>

2.7 最優(yōu)組貨架期的確定

2.7.1 醬肉在37℃下菌落總數(shù)的變化趨勢

由圖10可知，在37℃的條件下，隨著時間的增加，醬肉菌落總數(shù)增加趨勢較為明顯，在第8天時達到80000CFU/g，參考腌臘肉制品標準GB2730—2015[21]，醬肉已腐敗，可確定醬肉在37℃下貨架期為8 d。

圖10 醬肉在37℃下菌落總數(shù)的變化趨勢Fig.10 Variation trends of thetotal numbers of coloniesin sauced meat at 37℃

2.7.2 醬肉在27℃下菌落總數(shù)的變化趨勢

由圖11可知，在27℃下，隨著時間的增加，在第23天菌落總數(shù)達到80 000 CFU/g，根據(jù)GB 2730—2015[21]，醬肉已腐敗，可確定醬肉在27℃下貨架期為23 d。

2.7.3 醬肉貨架期的預(yù)測結(jié)果

本研究采用Q10貨架期預(yù)測模型對醬肉的貨架期進行預(yù)測[16,30-32]。綜合圖10和圖11得出27℃儲藏條件下的貨架期為23 d，37℃儲藏條件下的貨架期為8 d，帶入式（1）求出Q10，即Q10=t℃下的貨架期/（t+10）℃下的貨架期=23/8=2.875；預(yù)測得到常溫23℃下醬肉貨架期為Qs2(23℃)=Qs(t0)×Q10(t0-t)/10=23×2.875(27-23)/10=35 d，低溫7℃下醬肉貨架期為Qs3(7℃)=Qs(t0)×Q10(t0-t)/10=23×2.875(27-7)/10=190 d?？梢姷蜏貎Σ乜纱蟠笱娱L醬肉貨架期，應(yīng)用Arrhenius關(guān)系式建立貨架期預(yù)測模型可以在較高溫度下收集數(shù)據(jù)，然后用外推方法求得在較低溫度下的貨架壽命，大大縮減了貨架期試驗時間。

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定了山梨酸鉀、Nisin、雙乙酸鈉和乳酸鈉有效達到醬肉防腐目的的同時降低了亞硝酸鹽的殘留量。通過正交試驗及綜合分析，確定最優(yōu)復(fù)配組合為A3B1C1D3，各個防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.18 g/kg、雙乙酸鈉1.15 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。并且進行驗證試驗，試驗結(jié)果與預(yù)期相符，菌落總數(shù)為2.37×104CFU/g，揮發(fā)性鹽基氮含量為34.88 mg/100 g，亞硝酸鹽殘留量為3.15 mg/kg，與對照組相比降低了6.55 mg/kg，達到了降低亞硝酸鹽殘留量的目的。利用ASLT法測得醬肉在7℃貨架期為190 d，23℃常溫下可儲藏35 d左右，低溫儲藏更有利于醬肉的保存。