葡萄籽多酚對(duì)免疫抑制小鼠腸道菌群的影響

王 偉，布麗根·加冷別克，祖麗普努爾·麥提賽伊迪，娜迪熱·阿卜杜克熱木，游義琳，胡曉東

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

人體腸道（腸黏液、腸腔、糞便）中棲居著眾多的腸道微生物，總數(shù)可達(dá)1013～1014個(gè)，在腸道中形成一個(gè)復(fù)雜互作的菌群生態(tài)系統(tǒng)。腸道菌群編碼的基因可達(dá)人體自身基因的100倍左右[1]，在腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及腸道微生態(tài)平衡的狀態(tài)下，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對(duì)于機(jī)體物質(zhì)能量代謝、提高機(jī)體免疫力、協(xié)助機(jī)體抗感染等生理調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮具有十分重要的意義[2]。植物多酚是一類多羥基化合物，是廣泛存在于茶葉、葡萄、蘋果、酒類及多種水果和蔬菜中的具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物[3]。研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚不僅具有抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[4]，還能調(diào)節(jié)宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)控腸道菌群的代謝通路，刺激乙酸、丙酸及丁酸等短鏈脂肪酸（SCFAs）的產(chǎn)生[5]，這些SCFAs可以被腸道黏膜吸收，給予結(jié)腸腸壁細(xì)胞能源，對(duì)腸道健康起重要作用，同時(shí)還可以降低腸道pH，抑制一些致病菌的生長(zhǎng)[6]。

我國(guó)葡萄種植面積廣、產(chǎn)量高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約80%的葡萄被用來(lái)釀酒[7]。葡萄酒在加工過(guò)程中，一般會(huì)產(chǎn)生20%～25%左右的葡萄籽等廢棄物[8]，但其綜合利用水平仍有待提高。葡萄籽多酚是葡萄籽等廢棄物中的主要功能性成分之一，被認(rèn)為是一種天然的強(qiáng)效抗氧化劑[9]。此外，大量動(dòng)物試驗(yàn)表明葡萄籽多酚可以調(diào)節(jié)腸道活動(dòng)，改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能，例如：Collins等[10]發(fā)現(xiàn)葡萄籽多酚不僅可以增加肥胖小鼠的胰島素抗性，還能提升腸道中毛螺菌屬（Lachnospiraceae）的豐度；Choy等[11]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽多酚能夠增加雌豬腸道中毛螺菌屬（Lachnospiraceae）、梭菌屬（Clostridiales）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的豐度。鑒于目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中在葡萄籽多酚的抗氧化功效上，而有關(guān)葡萄籽多酚的免疫調(diào)節(jié)活性及其對(duì)免疫抑制小鼠腸道菌群的影響尚未進(jìn)行充分的研究。因此，本研究采用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CPA）誘導(dǎo)建立小鼠免疫抑制模型，通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)小鼠糞便樣本中細(xì)菌16SrDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行分析，解析免疫抑制小鼠腸道菌群的變化，以期為葡萄籽多酚在預(yù)防、治療、提高機(jī)體免疫力及臨床應(yīng)用等多方面提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

脫脂赤霞珠葡萄籽粉，由新疆天裕葡萄酒業(yè)有限公司贈(zèng)送；清潔級(jí)BALB/c小鼠，雌性，質(zhì)量18～22 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)0030557）。

免疫球蛋白試劑盒：南京建成生物工程研究所；糞便基因組DNA提取試劑盒：美國(guó)Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖，福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；環(huán)磷酰胺：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸、丙酸及丁酸）：北京中科質(zhì)檢生物有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

79-3型恒溫磁力攪拌器：上海司樂(lè)儀器廠；XP2001S精密天平：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺(tái)：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；OSB-2100型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本EYELA公司；Centrufuge5415R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；FE-20型pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；MiSeq測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽多酚的制備

參照仇菊等[12]的方法，稱取1.0 g脫脂葡萄籽粉樣品，加60%乙醇20 mL，避光置于80℃水浴中提取2 h，6 000 r/min離心10 min取上清液，40℃旋蒸濃縮至原體積1/6后，置于-40℃真空凍干48 h得到葡萄籽多酚提取物。

1.2.2 葡萄籽多酚含量的測(cè)定

參考Chu等[13]的方法，準(zhǔn)確稱取0.01 g葡萄籽多酚提取物，用0.4 mL的60%乙醇溶解，加入0.4 mol/L的福林酚試劑0.1 mL，混合均勻，30℃避光反應(yīng)5 min后加入7%的碳酸鈉溶液1 mL，再用蒸餾水定容至2.5 mL，避光反應(yīng)60 min后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在747 nm處測(cè)定吸光值。

同時(shí)以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸濃度為0.01～0.1 mg/mL），以吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：y=0.096 8x-0.013 4，R2=0.998 5。葡萄籽多酚提取物中總酚含量用沒(méi)食子酸當(dāng)量（Gallic acid equivalent，GAE）μg GAE/mg DW表示。

1.2.3 動(dòng)物分組處理

參照孔妮等[14]的方法，將40只清潔級(jí)BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別作為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組、葡萄籽多酚提取物（多酚含量為40μg GAE/mg DW）低劑量組及高劑量組。除空白對(duì)照組外，其余各組連續(xù)3 d腹腔注射CPA（80 mg/（kg·d）），建立免疫缺陷小鼠模型；隨后，葡萄籽多酚提取物給藥組每天灌胃給藥，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，確定葡萄籽多酚提取物低、高劑量組的給藥量分別為50、150 mg/（kg·d），灌胃量均為0.3 mL/只，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組每天灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)14 d。

1.2.4 免疫器官指數(shù)的測(cè)定

參照甘霓等[15]的方法，不同處理組的BALB/c小鼠末次灌胃給藥12 h后，采用乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死，取脾臟及胸腺，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)（mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.2.5 免疫球蛋白含量分析

參照孔妮等[14]和文艷巧等[16]的方法，于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠摘眼球采血，收集血液于Eppendorf管中室溫靜置4 h后，置于4℃冰箱過(guò)夜，4 000 r/min離心15 min收集血清，采用ELISA法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行IgG、IgM的檢測(cè)；同時(shí)從距盲腸3 cm處剪取結(jié)腸1.5 cm，平鋪于濾紙上，縱向切開(kāi)，暴露黏膜面，刮取腸黏液，收集于Eppendorf管中，再加入含0.1%蛋白酶抑制劑的0.01 mol/L冰浴磷酸鹽緩沖液1 mL，充分混勻，3 000 r/min離心15 min取上清液，采用ELISA法按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行sIgA檢測(cè)。

1.2.6 小鼠糞便的收集

小鼠灌胃給藥試驗(yàn)結(jié)束后，無(wú)菌稱取小鼠結(jié)腸末端成形新鮮糞便0.3 g左右迅速置于-80℃超低溫冰箱，待分析用。

1.2.7 小鼠糞便DNA的提取

小鼠糞便DNA利用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.8 小鼠腸道微生物16SrDNA高通量測(cè)序

參照文獻(xiàn)[17-18]，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)提取的小鼠糞便微生物DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。采用細(xì)菌16SrDNA V3-V4擴(kuò)增通用引物，測(cè)序引物為338F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），不同樣本在引物5’端加入6 bp條碼序列用于區(qū)分樣品。

1.2.9 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析處理

MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)使用TrimGalore、FLASH2及Mothur軟件進(jìn)行質(zhì)控拼接并去除低質(zhì)量堿基[19-20]，利用USearch軟件得到質(zhì)量和可信度較高的優(yōu)化序列，該數(shù)據(jù)用于后續(xù)生物信息分析。運(yùn)算分類單位（Operationaltaxonomicunit，OTU）聚類分析通過(guò)在QIIME中調(diào)用Uclust方法對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度0.97進(jìn)行聚類[21]，選取每個(gè)類最長(zhǎng)的序列為代表序列。OTU注釋通過(guò)在QIIME中采用BLAST的方法對(duì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)[22]，獲得每個(gè)OTU分類學(xué)信息，利用R軟件生成樣本間（或組間）OTU的維恩圖。根據(jù)OTU列表中的各樣品物種豐度情況，應(yīng)用Mothur軟件計(jì)算生物多樣性指數(shù)，并將優(yōu)勢(shì)菌門（屬）與短鏈脂肪酸（SCFAs）結(jié)合制成冗余分析圖。

1.2.10 盲腸內(nèi)容物SCFAs含量的測(cè)定

參照Alfa等[23]的方法，盲腸內(nèi)容物稱重后溶于1 mL去離子水中，充分振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清，經(jīng)0.22μm水相濾膜過(guò)濾，用于氣相色譜檢測(cè)。檢測(cè)條件：SH-Rtx-5柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），載氣氮?dú)?，總流?40 mL/min，進(jìn)樣口溫度280℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器300℃，不分流；采用程序升溫：初始溫度80℃，以3℃/min升溫至150℃，然后以20℃/min升溫至250℃保持2 min；進(jìn)樣量1μL。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽多酚對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體主要的免疫器官，免疫器官指數(shù)的改變是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫能力狀況的關(guān)鍵指標(biāo)[24]。葡萄籽多酚對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響如表1所示。

表1 葡萄籽多酚對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table1 Effects of grapeseed polyphenol on immune organs indexes of immunosuppressed mice 單位：mg/g

由表1可知：模型對(duì)照組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明小鼠免疫抑制模型造模成功；與模型對(duì)照組相比，葡萄籽多酚對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行干預(yù)后，小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明葡萄籽多酚可以在一定程度上保護(hù)小鼠的免疫器官，增強(qiáng)小鼠的免疫活性。

2.2 葡萄籽多酚對(duì)小鼠免疫球蛋白的影響

免疫球蛋白是免疫系統(tǒng)的有機(jī)組成部分，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，IgA是血清中含量?jī)H次于IgG的免疫球蛋白，對(duì)機(jī)體局部黏膜免疫起到非常重要的作用，特別是對(duì)經(jīng)黏膜途徑感染的病原微生物具有抵抗作用[25]，sIgA是消化道黏膜免疫最顯著的效應(yīng)分子，可在腸黏膜表面形成有效的防御屏障[26]。葡萄籽多酚對(duì)小鼠免疫球蛋白的影響如表2所示。

表2 葡萄籽多酚對(duì)免疫抑制小鼠免疫球蛋白的影響Table 2 Effects of grape seed polyphenol on immunoglobulin of immunosuppressed mice 單位：μg/mL

由表2可知：與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠免疫球蛋白含量（sIgA、IgM、IgG）顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明模型對(duì)照組小鼠體內(nèi)特異性抗體分泌較少，免疫功能受到限制；與模型對(duì)照組相比，葡萄籽多酚干預(yù)能夠增加小鼠免疫球蛋白含量（P＜0.05），與De Leblanc等[27]的研究結(jié)果一致，推測(cè)葡萄籽多酚能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更多抗體，引起小鼠機(jī)體的特異性體液免疫應(yīng)答，激發(fā)特異性抗體的大量產(chǎn)生，從而增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

2.3 腸道菌群Alpha多樣性分析

α多樣性反映的是樣品菌群豐度及菌群多樣性，有多種衡量指標(biāo)[28]。Chao1和ACE指數(shù)用來(lái)估計(jì)菌群豐度即菌群數(shù)量的多少，Shannon和Simpson指數(shù)用來(lái)估計(jì)樣本中菌群的多樣性，Coverage指各樣本文庫(kù)的覆蓋率[29]。由圖1可知，與模型對(duì)照組相比，低劑量葡萄籽多酚提取物樣品組中腸道菌群的數(shù)量最多（Chaol值469.09、ACE值459.45、Shannon值3.99、Simpson值0.04、Coverage值0.999 7）。這種現(xiàn)象可能是由于高劑量葡萄籽多酚提取物樣品組中的黃烷醇單體含量高于低劑量葡萄籽多酚提取物樣品組，而黃烷醇單體能夠與肽聚糖結(jié)合，破壞微生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有抑菌作用[30-31]。

圖1 小鼠腸道菌群的OTU數(shù)量及Alpha多樣性Fig.1 OTUnumber and Alpha diversity of gut microbiota in mice

2.4 腸道菌群Beta多樣性分析

不同分組間的樣本存在一定的特性和共性，Venn圖[32]可以篩選每組樣本中特有的OTU以及組間共有的OTU。不同樣品組中群落Venn圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同小鼠腸道菌群Venn圖Fig.2 Venn diagram of intestinal florain different mice

由圖2可知：空白對(duì)照組小鼠腸道菌群共得到499個(gè)OTU，模型對(duì)照組中腸道菌群共得到432個(gè)OTU，樣品低劑量組共得到561個(gè)OUT，樣品高劑量組中腸道菌群共得到457個(gè)OUT；其中空白對(duì)照組中特有腸道菌群的OTU為11個(gè)，模型對(duì)照組中特有腸道菌群的OTU為3個(gè)，樣品低劑量組中特有腸道菌群的OTU為72個(gè)，樣品高劑量組中特有腸道菌群的OTU為5個(gè)。由OTU數(shù)目分布Venn圖可以進(jìn)一步得出，葡萄籽多酚低劑量組微生物豐度最高，對(duì)于小鼠腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。

2.5 菌群構(gòu)成分析

不同樣品對(duì)小鼠腸道菌群構(gòu)成的影響如圖3A和圖3B所示。

圖3 門水平（A）及屬水平（B）的小鼠腸道菌群相對(duì)豐度柱狀圖Fig.3 Relativeabundance of phylum(A)and genus(B)levels of gut microbiota in mice

由圖3A可知：在門水平，除去未確定類群的腸道菌，主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria/Chloroplast）、軟壁菌門（Tenericutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）及浮霉菌門（Planctomycetes）組成；其中變形菌門主要包含沙門氏菌（Salmonella）等致病菌[33]，與模型對(duì)照組相比，葡萄籽多酚提取物低劑量樣品組中變形菌門相對(duì)豐度最低，約為模型對(duì)照組數(shù)量的8.14%，表明葡萄籽多酚提取物在小鼠腸道菌群的作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制了變形菌門的生長(zhǎng)繁殖；同時(shí)對(duì)各組樣品中厚壁菌門與擬桿菌門的相對(duì)豐度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，葡萄籽多酚低劑量組小鼠腸道中F/B值（F：厚壁菌門豐度值；B：擬桿菌門豐度值）較模型對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），F(xiàn)/B值由1.34增加到3.13，這與訾雨歌等[34]的研究結(jié)果相似，表明低劑量葡萄籽多酚干預(yù)可以顯著調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成。

腸道菌群微生態(tài)失衡會(huì)引起人體出現(xiàn)免疫性疾病、代謝性疾病和消化性疾病[35]。植物多酚對(duì)維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有較大作用[36]。研究表明，植物多酚類物質(zhì)可以抑制腸道內(nèi)有害菌群的生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)有益菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌等的生長(zhǎng)[37]。由圖3B可知：與模型對(duì)照組相比，葡萄籽多酚提取物干預(yù)顯著降低了巴恩斯氏菌屬（Barnesiella）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella）、艾克曼菌屬（Akkermansia）的相對(duì)豐度，且葡萄籽多酚提取物低劑量組中埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella）的相對(duì)豐度僅為模型對(duì)照組的2.54%。Jensen等[38]研究發(fā)現(xiàn)，埃希氏菌屬、顫螺菌屬、梭菌屬和瘤胃球菌屬可能會(huì)增加炎癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，葡萄籽多酚提取物干預(yù)能夠顯著增加乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、狄氏副擬桿菌屬（Parabacteroides distasonis）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、坦納擬普雷沃菌屬（Alloprevotella tannerae）、別樣棒菌屬（Allobaculum）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）的相對(duì)豐度，且葡萄籽多酚提取物低劑量組中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對(duì)豐度是模型對(duì)照組的1.38倍和56.72倍。Ejtahed等[39]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等益生菌具有顯著的益生效果，包括抑制致病菌、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等功效。Ren等[40]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌屬和雙歧桿菌屬等腸道益生菌屬，其數(shù)量與機(jī)體免疫能力在一定程度上呈正相關(guān)。Hua等[41]研究亦證明，乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等益生菌能夠刺激機(jī)體免疫功能，上調(diào)抗炎細(xì)胞因子，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物還能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的修復(fù)和再生，從而有效減少脂多糖的吸收。此外，Nami等[42]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌有利于調(diào)節(jié)腸道杯狀細(xì)胞的功能和促進(jìn)腸上皮釋放IgA和防御素等，同時(shí)二者有助于改善免疫系統(tǒng)應(yīng)答、抑制病原菌的定植以及增強(qiáng)腸道上皮屏障[43]。

2.6 小鼠盲腸中短鏈脂肪酸含量的測(cè)定結(jié)果

膳食多酚類物質(zhì)可能引起某些特定腸道微生物的數(shù)量變化，而腸道微生物也會(huì)影響多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化途徑和過(guò)程，如短鏈脂肪酸的產(chǎn)生[44]，乙酸、丙酸與丁酸在腸道中的含量最高，是腸道中主要的短鏈脂肪酸[45]。由表3可知，小鼠經(jīng)過(guò)CPA造模后，與模型對(duì)照組相比，葡萄籽多酚提取物干預(yù)后，小鼠盲腸中乙酸、丙酸、丁酸含量顯著升高（P＜0.05），與Henning等[46]、Sun等[47]的研究結(jié)果相似。短鏈脂肪酸可通過(guò)腸上皮細(xì)胞進(jìn)入并與宿主細(xì)胞相互作用，吸收后在血清中循環(huán)并影響宿主的免疫反應(yīng)和發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并可抑制具有促進(jìn)維持免疫穩(wěn)態(tài)的抗炎型細(xì)胞作用的組蛋白脫乙酰酶[48]。

表3 葡萄籽多酚對(duì)免疫抑制小鼠盲腸中短鏈脂肪酸含量的影響Table 3 Effect of grape seed polyphonel on short-chain fatty acids contentsin cecum of mice 單位：mmol/L

2.7 短鏈脂肪酸與腸道菌群分布的相關(guān)性分析

短鏈脂肪酸的濃度與腸道菌群與膳食密切相關(guān)[49]。經(jīng)Pearson相關(guān)分析可以得知，短鏈脂肪酸與腸道菌群的變化量存在相關(guān)性，如表4所示。其中：蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、坦納擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、別樣棒菌屬（Allobaculum）、Romboutsia屬、歐氏菌屬（Olsenella）、Murimonas屬、嗜膽菌屬（Bilophila）與乙酸、丙酸、丁酸含量存在顯著正相關(guān)（P＜0.05）；乳酸球菌屬（Lactococcus）及乳酸桿菌屬（Lactobacillus）與丙酸、丁酸含量存在顯著正相關(guān)（P＜0.05）；雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）與乙酸、丙酸含量存在顯著正相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明這些菌屬會(huì)在腸道中分解植物多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)短鏈脂肪酸的生成，短鏈脂肪酸通過(guò)腸上皮細(xì)胞進(jìn)入并與宿主細(xì)胞相互作用，吸收后在血清中循環(huán)并影響宿主的免疫反應(yīng)和發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)[48]。Jensen等[38]的研究亦表明，乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌可以通過(guò)分泌短鏈脂肪酸誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖和分化，塑造腸道內(nèi)穩(wěn)定的免疫系統(tǒng)，這就從代謝產(chǎn)物的角度驗(yàn)證了益生菌的益生作用。但Catabacter屬與乙酸、丙酸、丁酸含量存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；另枝菌屬（Alistipes）及臭味菌屬（Odoribacter）與乙酸含量存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；厭氧原體屬（Anaeroplasma）與丁酸含量存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這說(shuō)明短鏈脂肪酸可以抑制Catabacter屬、另枝菌屬（Alistipes）、臭味菌屬（Odoribacter）及厭氧原體屬（Anaeroplasma）等病原菌的增殖。Sanz等[50]研究表明，雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬的生長(zhǎng)與短鏈脂肪酸的生產(chǎn)有關(guān)，與本研究得到的結(jié)論一致。

表4 短鏈脂肪酸與腸道菌群分布之間的相關(guān)性系數(shù)分析表Table 4 Analvsis of correlation coefficient between SCFAsand gut microbiota distribution

3 結(jié)論

以葡萄籽多酚為研究對(duì)象，通過(guò)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)建立免疫抑制小鼠模型，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)探究葡萄籽多酚對(duì)免疫抑制小鼠腸道菌群的影響。結(jié)果表明：葡萄籽多酚干預(yù)能夠提高小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)以及免疫球蛋白（sIgA、IgM、IgG）含量，增強(qiáng)小鼠免疫功能；低劑量葡萄籽多酚干預(yù)能夠提高腸道菌群多樣性，促進(jìn)乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、狄氏副擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、蘇黎世桿菌屬、坦納擬普雷沃菌屬、別樣棒菌屬、Romboutsia屬的生長(zhǎng)，抑制巴恩斯氏菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬、艾克曼菌屬的生長(zhǎng)；同時(shí)，乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬等益生菌的增殖，有利于促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。該研究結(jié)果不僅為植物多酚改善人體健康提供可靠的理論依據(jù)，還為以腸道菌群為靶點(diǎn)通過(guò)益生元的攝入來(lái)預(yù)防各類慢性疾病帶來(lái)了全新的思路和方法，將在保健食品、特殊醫(yī)學(xué)用途食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。