表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大豆分離蛋白凝膠的影響

王晨笑，青舒婷，王丹鳳,鄭 妍，徐學(xué)兵，岳 進(jìn),3,*

（1.上海交通大學(xué)食品科學(xué)與工程系，上海 200240；2.豐益全球研發(fā)中心，上海 200240；3.上海交通大學(xué)四川研究院，四川 成都 610000）

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate,SPI）是食品工業(yè)中使用最廣泛的植物蛋白之一。SPI的蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)、變性和聚集程度對于其功能特性有較大影響。凝膠特性是蛋白質(zhì)非常重要的一種功能特性，蛋白質(zhì)凝膠可以在食品體系中提供一個容納水、脂肪、風(fēng)味物質(zhì)和食品成分的結(jié)構(gòu)基體。SPI凝膠被廣泛用于肉類產(chǎn)品中，包括香腸、午餐肉和丸子等傳統(tǒng)肉類產(chǎn)品或人造肉等新型肉類產(chǎn)品[1]。誘導(dǎo)SPI形成凝膠的常用方法有熱誘導(dǎo)、酸誘導(dǎo)、鹽誘導(dǎo)和酶誘導(dǎo)等，通過不同方法形成的凝膠在機(jī)械性能、流變性能、質(zhì)地及保水能力方面各不相同。熱誘導(dǎo)是指通過加熱使球蛋白天然致密結(jié)構(gòu)展開，從而導(dǎo)致原本被掩埋的疏水性殘基暴露，進(jìn)而促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的聚集[2]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Glutamine Transaminase,TGase）又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，是一種蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，可通過催化蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰胺的λ-羧酰胺與賴氨酸之間的?；D(zhuǎn)移，形成ε-（λ-谷氨酰胺）-賴氨酸交聯(lián)鍵來修飾蛋白質(zhì)[3-4]。

由于SPI凝膠的硬度和黏彈性較差，限制了其應(yīng)用，通常需要經(jīng)過改性或加入一些交聯(lián)劑進(jìn)行輔助，增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度[5-6]。在食品體系中，當(dāng)酚類化合物與蛋白質(zhì)均存在時，其間會發(fā)生相互作用使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的一些功能特性，如乳化性和凝膠特性等[7]。這一相互作用可以以共價或非共價方式發(fā)生：在堿性條件下，多酚可以被氧化為醌，與蛋白質(zhì)的巰基或氨基發(fā)生不可逆的相互作用，從而通過酚環(huán)形成共價結(jié)合；而非共價相互作用主要通過氫鍵、范德華力和疏水相互作用實現(xiàn)[8]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin Gallate,EGCG）是綠茶中最豐富、最活躍的兒茶素單體，其分子結(jié)構(gòu)包含3個芳香環(huán)，1個吡喃環(huán)和8個酚羥基。由于EGCG分子具有多個羥基，使其具有卓越的功能特性和理化活性，包括常見酚類化合物中較高的自由基清除能力、抗炎癥能力、降血脂能力和癌癥抑制能力[9]。目前已有一些研究關(guān)注到多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生變化[10-11]。劉勤勤等[12]發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以與SPI中的色氨酸殘基發(fā)生相互作用，改變SPI的分子構(gòu)象。Jia等[13]報道，乳清蛋白與EGCG之間的共價相互作用改變了乳清蛋白的構(gòu)象結(jié)構(gòu)并改善了其理化特性。李楊等[14]發(fā)現(xiàn)與EGCG復(fù)合后的SPI乳化特性顯著提高。但多酚類物質(zhì)與SPI共同形成凝膠的研究鮮有報道。

本研究重點考察EGCG對熱誘導(dǎo)和TG誘導(dǎo)的SPI凝膠特性的影響，以表面疏水性、自由巰基含量、內(nèi)源熒光光譜和圓二色譜探究EGCG對SPI結(jié)構(gòu)的影響，并分析了EGCG/SPI凝膠體系的作用力、機(jī)械性能、流變學(xué)特性和微觀結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)含量85.1%），由豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司提供；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），純度＞95%，購自僑怡生物科技（上海）有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG），購自江蘇一鳴生物股份有限公司。試驗中所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；J-815圓二色光譜儀，日本JASOC公司；TA.XTPlus Texture Analyzer質(zhì)構(gòu)儀，英國StableMicroSystems公司；Haake-RheoStress6000流變儀，美國賽默飛公司；D-1903拉曼圖像-掃描電子顯微鏡聯(lián)用儀，捷克WITec公司。

1.2 方法

1.2.1 SPI-EGCG復(fù)合凝膠的制備

用磷酸緩沖液（0.1 mol/L,pH 7.4）溶解SPI，磁力攪拌2 h，配制成12%的溶液備用。將EGCG（0.01、0.02、0.05 g/g）加入SPI溶液制備混合液。取適量樣品，用磷酸緩沖液（0.1mol/L,pH 7.4）稀釋至SPI濃度為1 mg/mL，用于蛋白性質(zhì)測定。

參考Ben-Harb等[2]的方法，采用熱誘導(dǎo)與酶誘導(dǎo)兩種方法制備SPI-EGCG復(fù)合凝膠。將SPI-EGCG混合物置于90℃加熱30 min，然后放入冰水浴中冷卻，4℃下穩(wěn)定24 h后，制得熱誘導(dǎo)凝膠。在SPI-EGCG混合物中加入TG（50 U/g）后在45℃下保持2 h，制得酶誘導(dǎo)凝膠。

1.2.2 蛋白表面疏水性

表面疏水性能采用熒光法測定，熒光探針選用8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）。取一定量的混合物稀釋至SPI濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL。分別取不同濃度稀釋樣品4 mL，在390 nm激發(fā)波長和470 nm發(fā)射波長下分別測定樣品的熒光強(qiáng)度（FI0）和樣品加入20μL ANS溶液（8 mmol/L）后的熒光強(qiáng)度（FI1），兩者差值記為FI。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)I為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)，記為H0。

1.2.3 自由巰基含量

準(zhǔn)確稱取10.42 g Tris、6.76 g甘氨酸和1.49 g EDTA溶于900 mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8.0后，定容至1 L，得標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液。準(zhǔn)確稱取0.2 g 5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶于50 mL標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，制得Ellman試劑。

取1 mg/mL的SPI溶液4 mL，加入40μLEllman試劑，混勻后于25℃恒溫水浴中保溫45 min，用紫外分光光度計在412 nm波長下測定吸光值。以不加樣品只加Ellman試劑作為試劑空白，以Ellman試劑只加樣品溶液作為樣品空白。游離巰基含量可以通過下式計算得出：

式中：A412為除去樣品空白和試劑空白后的吸光值；D為稀釋倍數(shù)；13 600為DTNB的摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）；C為樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

1.2.4 內(nèi)源熒光光譜

使用熒光酶標(biāo)儀獲得SPI-EGCG復(fù)合物的內(nèi)源熒光光譜。激發(fā)波長設(shè)定為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別設(shè)定為5 nm。發(fā)射波長范圍設(shè)置為300～400 nm，掃描速度為10nm/s。

1.2.5 蛋白二級結(jié)構(gòu)

采用圓二色譜（Circular Dichroism,CD）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。參考Zhou等[15]的方法，選擇0.1 mg/mL的蛋白質(zhì)濃度用于CD光譜分析。在室溫下，用圓二色光譜儀在240～190 nm下掃描樣品，掃描速度為1 nm/s，帶寬為1.0 nm，響應(yīng)時間為0.25 s。收集的光譜數(shù)據(jù)通過DICHROWEB軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 凝膠分級溶解度

參考Gómez-Guillén等[16]的方法。將3 g凝膠樣品與30 mL的四種溶劑混合：0.6 mol/L氯化鈉（S1）；0.6 mol/L氯化鈉+1.5 mol/L尿素（S2）；0.6 mol/L氯化鈉+8 mol/L尿素（S3）；0.6 mol/L氯化鈉+8 mol/L尿素+0.5 mol/Lβ-巰基乙醇（S4）。將混合物以9 000 r/min離心15 min，并收集上清液。將5 mL 20%三氯乙酸添加到等體積的上清液中，并放置在冰箱中過夜以沉淀蛋白質(zhì)。之后，將混合物以7 200 r/min離心20 min，收集沉淀，并將沉淀物溶解于1 mol/L的NaOH中，用縮二脲法測定蛋白質(zhì)含量。凝膠在S1、S2、S3、S4中的溶解度分別代表離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的貢獻(xiàn)。

1.2.7 凝膠流變特性

參考Pang等[17]的方法，使用流變儀分析凝膠的流變特性。使用直徑27 mm的圓形平板探頭進(jìn)行測量，測量間距為1 mm。將混合物倒在流變儀上，按照測量間距設(shè)置探頭位置，覆蓋一層石蠟油，按照“1.2.1”的方法在流變儀上制備凝膠，并進(jìn)行0.1%～100%，1 Hz的應(yīng)變掃描。

1.2.8 凝膠強(qiáng)度

參考Li等[18]的方法，使用質(zhì)構(gòu)儀在室溫下分析凝膠的強(qiáng)度。使用圓柱形探針（直徑30 mm），測試前速度為1.5 mm/s，測試速度和測試后速度均為1.0 mm/s，壓縮距離和觸發(fā)力分別為4.0 mm和5 g。最大持續(xù)壓縮力即為凝膠強(qiáng)度。

1.2.9 凝膠形態(tài)

根據(jù)Wu等[19]的方法，使用掃描電子顯微鏡觀察SPI凝膠形態(tài)。將3 g樣品在2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）中固定1 h，浸入磷酸鹽緩沖液中在4℃冰箱中保存24 h。將樣品用磷酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）漂洗3次，每次15 min，并將樣品凍干。掃描電子顯微鏡在5 kV加速電壓下觀察固定樣品。

1.2.10 凝膠持水力（WHC）

參考Liu等[20]的方法，略有改動。將凝膠在4℃下用9 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，除去上清液后，記錄離心前后離心管和凝膠的總質(zhì)量。WHC（%）可以通過以下公式計算得出：

式中：m0為空管的質(zhì)量（g），m1和m2分別代表離心前后管和凝膠的質(zhì)量（g）。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

凝膠強(qiáng)度試驗重復(fù)10次，其他每項試驗重復(fù)3次。均值和標(biāo)準(zhǔn)差的統(tǒng)計分析通過SPSS26.0完成，使用Duncan多范圍檢驗（P＜0.05）進(jìn)行單向方差分析，以檢測平均值之間的顯著性差異。使用OriginPro 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI表面疏水性和自由巰基含量

SPI的表面疏水性隨EGCG濃度的增加而增強(qiáng)（圖1）。蛋白質(zhì)的表面疏水性主要是由聚集的非極性基團(tuán)與水分子之間的排斥作用力引起的[21]，EGCG可以與蛋白質(zhì)中的疏水基團(tuán)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致這一作用力增強(qiáng)。加入EGCG促進(jìn)SPI自由巰基含量的增加，且低濃度下增加明顯（圖1），這表明EGCG與蛋白質(zhì)的非共價結(jié)合促進(jìn)了蛋白質(zhì)的展開，使得更多的巰基被暴露。多酚對蛋白質(zhì)表面疏水性和自由巰基含量的影響已有較多報道，Jiang等[22]發(fā)現(xiàn)，花青素的添加對SPI自由巰基含量有較大影響，在添加較高濃度花青素時可能生成SPI-花青素共價復(fù)合物，使自由巰基含量有所下降。

圖1 EGCG 添加量對SPI表面疏水性和自由巰基含量的影響Fig.1 Effects of EGCG additions on surface hydrophobicity and free sulfhydryl contents of SPI

2.2 SPI內(nèi)源熒光光譜

天然蛋白質(zhì)分子中的色氨酸和酪氨酸殘基是內(nèi)源熒光的主要來源。SPI在325 nm處顯示出最大發(fā)射波長（圖2），加入EGCG降低了SPI的熒光強(qiáng)度，這可能是由于SPI結(jié)構(gòu)由于EGCG的加入發(fā)生展開，色氨酸殘基暴露程度增加，被親水環(huán)境包圍。較高濃度EGCG使SPI的最大發(fā)射峰出現(xiàn)輕微紅移（6 nm）。Sui等[23]發(fā)現(xiàn)，花青素-SPI非共價復(fù)合物具有更低的蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度，證明了SPI和花青素之間的相互作用誘導(dǎo)了SPI多肽鏈的解鏈和結(jié)構(gòu)變化。

圖2 EGCG 添加量對SPI內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.2 Effects of EGCG additions on fluorescence spectra of SPI

2.3 SPI二級結(jié)構(gòu)

與未添加EGCG的SPI相比，添加EGCG后SPI的無序結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）含量明顯增加，β-折疊含量明顯減少（表1）。這一結(jié)果說明EGCG的加入導(dǎo)致SPI的聚集程度降低，蛋白質(zhì)鏈出現(xiàn)松弛和拉伸，分子柔性增強(qiáng)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由氫鍵維持[24]，而以上變化可能有助于SPI在凝膠形成過程中發(fā)生更多氫鍵之間的相互作用，形成更強(qiáng)的凝膠結(jié)構(gòu)。Cao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，多酚的添加會破壞維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)的展開，從而導(dǎo)致在凝膠形成過程中形成更多的氫鍵。

表1 EGCG添加量對SPI二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of EGCGadditionson the secondary structure of SPI

2.4 SPI凝膠分級溶解度

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等化學(xué)力的作用使蛋白質(zhì)形成凝膠[26]。特定的化學(xué)試劑可以裂解特定的作用力，使凝膠部分溶解于其中，溶解的蛋白質(zhì)含量與凝膠中該作用力的大小有關(guān)[17]。不同EGCG添加量下的SPI凝膠的分級溶解度如圖3所示。TG可以在蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)形成ε-（γ-谷氨?；?賴氨酸交聯(lián)，建立穩(wěn)定的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，從而形成凝膠[3]，因而在TG誘導(dǎo)的SPI凝膠中的四種化學(xué)力均顯著低于熱誘導(dǎo)的SPI凝膠（P＜0.05）。形成熱凝膠的主要化學(xué)力為二硫鍵和疏水相互作用，EGCG的添加增強(qiáng)了熱凝膠的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵。一方面，多酚的添加有助于凝膠網(wǎng)絡(luò)中氫鍵的形成，并且二級結(jié)構(gòu)的變化使得更多氫鍵可以相互作用；另一方面，由于EGCG的添加造成的蛋白質(zhì)鏈拉伸使得其表面疏水性增強(qiáng)，二硫鍵增多，由自由巰基間的交聯(lián)反應(yīng)驅(qū)動的熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集增加，使得疏水相互作用及二硫鍵在SPI熱凝膠網(wǎng)絡(luò)中的數(shù)量增加，特別是在較低濃度EGCG的情況下[27-28]。

圖3 不同EGCG 添加量對SPI凝膠分級溶解度的影響Fig.3 Effects of EGCG additions on protein fractional solubility of SPIgels

2.5 SPI凝膠機(jī)械性能

儲存模量（G’），又稱彈性模量，可以反映在某些應(yīng)變或應(yīng)力下凝膠的能量存儲能力[29]。由圖4可知，TG誘導(dǎo)凝膠儲存模量明顯高于熱誘導(dǎo)凝膠，這是由于熱凝膠和酶凝膠形成機(jī)理不同，機(jī)械性能存在較大差異，而EGCG的添加均增加這兩種SPI凝膠的儲存模量，因為EGCG使凝膠結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，凝膠表現(xiàn)出更強(qiáng)的彈性和對抗應(yīng)力的能力。EGCG添加量為0.01 g/g時，兩種SPI凝膠的儲存模量最大，更高的EGCG添加量反而使儲存模量下降，可能由于高濃度的多酚使聚集蛋白質(zhì)之間的相互作用減弱，削弱凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Ai等[30]在堿誘導(dǎo)的鴨蛋蛋清凝膠中添加茶多酚，同樣發(fā)現(xiàn)較高的茶多酚濃度會使凝膠的儲存模量降低。

圖4 不同EGCG 添加量對SPI凝膠彈性模量的影響Fig.4 Effects of EGCG additionsonelastic modulus of SPIgels

由圖5可知，加入EGCG，凝膠強(qiáng)度增大，TG誘導(dǎo)的SPI凝膠強(qiáng)度均高于熱誘導(dǎo)的SPI凝膠，說明酶誘導(dǎo)的凝膠具有更牢固緊密的結(jié)構(gòu)，所能承受的最大壓力更大。另外，隨著EGCG添加量的增加，SPI凝膠的凝膠強(qiáng)度先升高后降低，與儲存模量的變化趨勢一致。這同樣可以說明當(dāng)EGCG添加量過高時會減弱蛋白之間的分子相互作用，使得凝膠強(qiáng)度下降。

圖5 EGCG 添加量對SPI凝膠強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of EGCG additions on the gel strength of SPIgels

2.6 SPI凝膠微觀結(jié)構(gòu)

在熱誘導(dǎo)凝膠化過程中，分子會逐漸舒展并隨后發(fā)生聚集，進(jìn)而形成不可逆的凝膠結(jié)構(gòu)[31]。未添加EGCG的熱凝膠表面粗糙，凝膠網(wǎng)絡(luò)稀疏（圖6A）。隨著EGCG的加入，凝膠網(wǎng)絡(luò)變得更加規(guī)則和均勻，孔徑減小，表明凝膠形成了更多的三維結(jié)構(gòu)。與熱凝膠相比，酶凝膠具有更致密和均勻的結(jié)構(gòu)。并且添加0.01、0.02 g/g EGCG同樣使蛋白質(zhì)凝膠表現(xiàn)出更為精細(xì)且多孔的結(jié)構(gòu)（圖6F、G），說明EGCG的添加可以在一定程度上改善蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而當(dāng)EGCG添加量增加到0.05 g/g時，SPI熱凝膠與酶凝膠的孔徑又變大，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的松散也使得其彈性模量與凝膠強(qiáng)度下降。與該結(jié)果相似，Zhu等[32]發(fā)現(xiàn)，谷酰胺轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)的凝膠具有更均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)以及更小的孔分布，其凝膠強(qiáng)度更強(qiáng)，持水力更好。

圖6 SPI凝膠掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of SPIgels

2.7 SPI凝膠持水力

對于熱誘導(dǎo)和酶誘導(dǎo)形成的SPI凝膠，添加EGCG均能提高凝膠的持水力（表2）。這可能由于添加EGCG造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，形成高密度的孔結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的凝膠，從而有效固定水分。相比于熱誘導(dǎo)SPI凝膠，酶誘導(dǎo)SPI凝膠具有更高的持水力，這得益于其更穩(wěn)定和致密的結(jié)構(gòu)。熱誘導(dǎo)SPI凝膠持水力隨EGCG添加量的增加而持續(xù)增強(qiáng)，說明蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)更牢固，可以較好地保留其中的水，并且更為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)也阻止了水分子的滲出。Dai等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在熱誘導(dǎo)形成肌球蛋白凝膠過程中加入咖啡酸可以增強(qiáng)其凝膠強(qiáng)度和持水力，因為咖啡酸可以增強(qiáng)肌球蛋白的疏水作用和氫鍵，加速肌球蛋白的凝膠形成。

表2 EGCG添加量對SPI凝膠持水力的影響Table 2 Effects of EGCGadditionson thewater holding capacity of SPIgels

3 結(jié)論

EGCG與SPI間的非共價結(jié)合可以引起SPI構(gòu)象的變化，使其表面疏水性、自由巰基含量增加，蛋白鏈?zhǔn)嬲?。在SPI熱誘導(dǎo)和酶誘導(dǎo)凝膠形成過程中加入EGCG可以使SPI發(fā)生更多交聯(lián)和相互作用，增強(qiáng)了熱凝膠的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵作用力，提高熱凝膠和酶凝膠的機(jī)械性能和持水力，特別是在酶凝膠中。0.01 g/g的EGCG添加量下，兩種凝膠具有最高的儲存模量和凝膠強(qiáng)度，凝膠結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定。因此，在蛋白凝膠形成過程中加入多酚可以改善凝膠結(jié)構(gòu)，促進(jìn)更大強(qiáng)度凝膠的形成。在后續(xù)研究中，可以結(jié)合核磁共振波譜等手段測定結(jié)合位點與數(shù)目，進(jìn)一步探究EGCG和SPI的相互作用機(jī)理，闡明其在凝膠形成過程中的變化。