紅景天苷在抗骨質(zhì)疏松癥中的作用及相關(guān)機(jī)制研究

劉雷 張明煥 陶圣祥 毛文△

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)[1]是一種全身性的骨骼系統(tǒng)疾病，骨質(zhì)疏松癥患者在大量骨質(zhì)丟失后自身骨骼的骨皮質(zhì)強(qiáng)度下降、骨小梁結(jié)構(gòu)被破壞[2]，比普通人更容易發(fā)生骨折[3]，致殘率和死亡率大大增加。因此，對(duì)治療和改善骨質(zhì)疏松癥的藥物的研究具有重要的價(jià)值和意義。

紅景天苷(Salomycin,SAL)具有保護(hù)心腦血管、視網(wǎng)膜等器官，抗缺氧、輻射，抗炎、抗氧化衰老，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌降糖，調(diào)節(jié)免疫功能等顯著功效[4]。有研究顯示紅景天苷通過(guò)影響糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松癥大鼠的瘦素表達(dá)，能降低糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松癥大鼠的血糖水平，升高糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清中瘦素的濃度和脛骨的骨密度[5]。然而，有關(guān)紅景天苷在抗骨質(zhì)疏松癥中的作用和機(jī)制尚缺乏全面的研究。本研究分析紅景天苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)細(xì)胞成骨分化及骨強(qiáng)度和骨小梁面積的影響，并建立去卵巢骨質(zhì)疏松癥小鼠模型，探討紅景天苷在抗骨質(zhì)疏松癥中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 小鼠骨質(zhì)疏松癥模型建立及檢測(cè)

選取10只8周齡雌性C57小鼠，麻醉下手術(shù)切除卵巢，術(shù)后行抗生素治療3 d并進(jìn)行傷口護(hù)理，正常飼養(yǎng)8周后開始建立小鼠骨質(zhì)疏松癥模型，8周后小鼠均存活良好，傷口愈合良好，無(wú)感染等并發(fā)癥發(fā)生。實(shí)驗(yàn)分為紅景天苷組(灌胃100 mg/(kg·次))和對(duì)照組(生理鹽水灌胃100 mg/(kg·次))，灌胃處理：隔日灌胃1次，連續(xù)灌胃5次，結(jié)束后繼續(xù)正常飼養(yǎng)4周，然后斷頸處死小鼠，提取小鼠的股骨行抗彎壓強(qiáng)度分析，提取小鼠的脛骨進(jìn)行microCT檢測(cè)并記錄骨小梁面積。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)

細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用α-MEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清及1%雙抗)培養(yǎng)小鼠的BMSCs細(xì)胞，在細(xì)胞專用培養(yǎng)箱中進(jìn)行多代培養(yǎng)，并采用第4～6代BMSCs細(xì)胞進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為紅景天苷處理組(60 μmol/L)和PBS處理對(duì)照組。

1.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

應(yīng)用TRIzol方法提取本次實(shí)驗(yàn)中的血液及細(xì)胞的RNA，以PrimeScriptⅢRT試劑盒進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)的逆轉(zhuǎn)錄操作培養(yǎng)，獲得cDNA，用SYBR@PremixExTaqlM試劑進(jìn)行mRNA的qPCR 的相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，ALP、BMP-2引物由上海吉?jiǎng)P公司提供。以2-△△Ct法計(jì)算，以β-actin作為內(nèi)參，獲取本次實(shí)驗(yàn)樣本中mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 堿性磷酸酶染色

染色堿性磷酸酶(ALP)在成熟成骨細(xì)胞中標(biāo)志性表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)中作為一種標(biāo)志性酶，在堿性條件下BMSCs細(xì)胞內(nèi)的ALP能水解磷酸萘酚并產(chǎn)生萘酚，萘酚被重氮鹽捕獲后可以產(chǎn)生不溶性的藍(lán)色沉淀物。參考?jí)A性磷酸酶染色試劑盒說(shuō)明書，ALP染色步驟簡(jiǎn)要概括為：實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別制備各自細(xì)胞爬片，取處理后第7天的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用試劑中的1號(hào)液滴加在細(xì)胞爬片上，在室溫下固定1～2 min后，用PBS漂洗2次，晾干后再滴加提前配置的試劑作用液，后置于37 ℃孵育器中孵化2～4 h，用PBS漂洗2遍，晾干，在顯微鏡下觀察并拍照得到相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 茜素紅染色

成骨分化的標(biāo)志是鈣結(jié)節(jié)的形成，沉積在細(xì)胞外的鈣結(jié)節(jié)能與茜素紅染液發(fā)生明顯的顯色現(xiàn)象，而細(xì)胞外形成鈣結(jié)節(jié)數(shù)量的多少能很好地反映出成骨分化的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)步驟概括為：將細(xì)胞置于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，選取第7天的細(xì)胞，取出細(xì)胞培養(yǎng)孔板，除去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS沖洗2～3次，在室溫條件下，以95%的乙醇固定15 min，再用雙蒸水沖洗2～3遍，于每孔中添加pH值為8.3的0.1%茜素紅-Tris-Hcl 2 mL染色，后在37 ℃環(huán)境下進(jìn)行60 min的孵育，最后用雙蒸水沖洗2～3遍并晾干，在顯微鏡下觀察、拍照，最后隨機(jī)選取5個(gè)視野并記錄鈣結(jié)節(jié)的數(shù)目。

1.6 Western Blotting檢測(cè)

除去孔板中的培養(yǎng)基后，用PBS沖洗2遍，用細(xì)胞裂解液對(duì)細(xì)胞裂解15 min，在離心機(jī)中以12 000 r/min離心15 min，最后提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)細(xì)胞的蛋白濃度。每孔上樣蛋白50 μg后，采用10%分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，以β-actin作為內(nèi)參，將蛋白轉(zhuǎn)至PFDV膜上。在室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入兔抗人的ALP、BMP-2一抗，在4 ℃孵化器中孵育過(guò)夜。每次洗膜15 min，總計(jì)洗膜3次，然后加入有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，在室溫條件下孵育1 h，后同樣每次15 min洗膜3次，在ECL下顯影曝光，記錄各個(gè)條帶的灰度值，匯總后計(jì)算蛋白相對(duì)灰度值比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化

堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示紅景天苷組中BMSCs成骨分化能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組，將實(shí)驗(yàn)中上清液提取以415 nm吸光度值進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示紅景天苷組ALP活性(0.944±0.132)高于對(duì)照組(0.714±0.134)，P<0.05；茜素紅染色結(jié)果(圖1)顯示紅景天苷組細(xì)胞礦化程度明顯高于對(duì)照組；兩組鈣化結(jié)節(jié)量化處理后結(jié)果顯示紅景天苷組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目(24.40±5.20)高于對(duì)照組(16.55±4.40)，P<0.05。

圖1 茜素紅染色結(jié)果(×40)

2.2 紅景天苷促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)7 d后，檢測(cè)兩組細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示紅景天苷組小鼠BMSCs成骨分化基因ALP、BMP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，見表1。Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紅景天苷上調(diào)組小鼠BMSCs成骨分化基因ALP、Runx2的蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，見圖2。

表1 兩組小鼠BMSCs成骨分化基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 Western Blotting檢測(cè)兩組細(xì)胞成骨分化蛋白表達(dá)比較

2.3 兩組骨質(zhì)疏松癥模型小鼠的股骨強(qiáng)度和脛骨骨小梁面積比較

兩組骨質(zhì)疏松癥模型小鼠股骨抗彎壓結(jié)果顯示紅景天苷組小鼠股骨抗彎強(qiáng)度(832.95±65.36)N/mm高于對(duì)照組(776.39±41.64)N/mm；microCT檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示紅景天苷組小鼠股骨下段骨小梁面積(21.68±4.89)μm2大于對(duì)照組(16.47±3.65)μm2，見表2。

圖3 兩組小鼠股骨遠(yuǎn)端microCT檢測(cè)結(jié)果

表2 兩組骨質(zhì)疏松癥模型小鼠股骨強(qiáng)度和脛骨骨小梁面積比較

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種老年退行性疾病，且與社會(huì)人口老年化密切相關(guān)，隨著人類壽命延長(zhǎng)，患病的風(fēng)險(xiǎn)增加，骨質(zhì)疏松癥[6]的嚴(yán)重后果是發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折，而有文獻(xiàn)表明[7]后天環(huán)境因素在骨質(zhì)流失過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[8]。有些藥物[9]在一定程度上可以抑制骨質(zhì)流失、增強(qiáng)骨質(zhì)強(qiáng)度[10]，目前針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制已研發(fā)出多種藥物，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)中取得較好的效果，例如降鈣素能減少破骨細(xì)胞數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞功能，減少骨量丟失；雙磷酸鹽能特異性結(jié)合到骨重建活躍的骨表面，抑制破骨細(xì)胞功能，從而抑制骨吸收。越來(lái)越多的證據(jù)表明中藥對(duì)于抗骨質(zhì)疏松癥也有很好的效果且其副作用小。

紅景天苷被譽(yù)為“高原人參”[11]，對(duì)各種慢性疾病具有多種治療效果，具有增加免疫力、抗腫瘤等功效[12]，因此在臨床上有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值[13]。骨質(zhì)疏松發(fā)生過(guò)程中的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，主要特征是持續(xù)骨形成下降伴有早期一過(guò)性骨吸收增加[14]，其體內(nèi)機(jī)制為成骨細(xì)胞減少或功能下降，破骨細(xì)胞增加或功能增強(qiáng)，導(dǎo)致骨質(zhì)形成減少、丟失增加，體內(nèi)總體骨量丟失。因此在抗骨質(zhì)疏松癥中，促進(jìn)成骨細(xì)胞增加或抑制破骨細(xì)胞生成意義重大。ALP和BMP-2在成骨細(xì)胞分化和形成的通路中有至關(guān)重要的作用，能顯著增加成骨細(xì)胞的分化能力。有研究顯示紅景天苷能激活A(yù)KT信號(hào)通路來(lái)達(dá)到抗氧化應(yīng)激、減少凋亡損傷的作用。目前紅景天苷在抗骨質(zhì)疏松癥中的作用尚未見報(bào)道，本研究中紅景天苷能明顯提升細(xì)胞中ALP和BMP-2的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和形成，增加成骨作用，減少骨質(zhì)流失。

成骨分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、ALP活性檢測(cè)和茜素紅染色結(jié)果顯示：紅景天苷能促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[15]成骨分化，而且紅景天苷能上調(diào)BMSCs成骨分化基因ALP和BMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)。ALP和BMP-2在成骨細(xì)胞的分化過(guò)程和骨基質(zhì)形成中起著關(guān)鍵作用，ALP和BMP-2也參與了多種信號(hào)通路過(guò)程，如力學(xué)刺激-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、甲狀旁腺激素信號(hào)通路、骨形態(tài)蛋白的發(fā)生等[16]。ALP和BMP-2在成骨分化的多種信號(hào)通路中起著中心作用[16]，因此，紅景天苷可能通過(guò)ALP和BMP-2信號(hào)通路調(diào)控干細(xì)胞成骨分化過(guò)程。通過(guò)建立骨質(zhì)疏松癥小鼠模型，紅景天苷處理后組織學(xué)定量分析結(jié)果顯示紅景天苷組骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨小梁面積增加，骨質(zhì)疏松程度得到改善，而且力學(xué)檢測(cè)顯示紅景天苷組骨質(zhì)疏松癥小鼠股骨力學(xué)性能也得到一定程度恢復(fù)。因此，本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)紅景天苷組小鼠骨質(zhì)疏松癥程度得到顯著改善。有研究者通過(guò)建立小鼠胚胎成骨細(xì)胞體外過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化脅迫模型和卵巢切除小鼠的骨質(zhì)疏松癥模型來(lái)研究紅景天苷作用原理，結(jié)果顯示紅景天苷能明顯改善骨質(zhì)疏松，能很好地抑制骨吸收介質(zhì)的釋放，并且保護(hù)成骨細(xì)胞免受氧化損傷，以此來(lái)達(dá)到減輕骨質(zhì)疏松的目的[17-18]。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明紅景天苷具有改善骨質(zhì)疏松的作用，能促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化能力，改善小鼠骨質(zhì)疏松程度，其機(jī)制與ALP和BMP-2相關(guān)。