健腰密骨片延緩OPG基因敲除小鼠椎間盤退變的研究

薛純純 王擁軍 梁倩倩 施杞 李曉鋒△

骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)在骨代謝調控過程中具有重要的作用[1]，全身性OPG基因敲除小鼠(OPG-/-小鼠)出現嚴重的骨質疏松表型[2]，因此后續(xù)的研究以該模式動物為研究對象，主要聚焦于以骨質疏松為主的骨代謝疾病中[3-5]，關于軟骨退行性疾病(如椎間盤退變)的研究較少。

多種細胞表達和分泌OPG，軟骨細胞和纖維環(huán)細胞同樣表達OPG[6]，筆者發(fā)現OPG-/-小鼠隨著增齡椎間盤退變逐漸加重，軟骨終板部分骨化[7]，炎性因子表達，新生血管形成[8]。健腰密骨片是上海市名中醫(yī)施杞教授治療骨質疏松癥的經驗方，原發(fā)骨質疏松癥和椎間盤退變均屬于骨或/和關節(jié)的退行性疾病，基于中醫(yī)“腎主骨”和異病同治原則，采用健腰密骨片早期干預OPG-/-小鼠，觀察該方是否具有延緩OPG-/-小鼠椎間盤退變的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級10周齡雄性OPG-/-小鼠和WT小鼠購自上海南方模式生物中心(合格證號：SCXK(滬)2005-0002)，其中OPG-/-小鼠20只，WT小鼠10只，飼養(yǎng)在SPF級動物房，自由進食及飲水。適應性飼養(yǎng)2周后，30只小鼠隨機分為3組，分別為WT、OPG-/-、健腰密骨片組，每組各10只。

1.2 主要試劑

免疫組化試劑盒(美國Invitrogen公司)，Trizol(美國Sigma公司)，逆轉錄試劑盒和熒光定量試劑(大連寶生物工程有限公司)，蛋白酶K(德國Merck公司)，多克隆兔抗I型膠原抗體(美國Abcam公司)，多克隆兔抗Ⅱ型和Ⅹ型膠原抗體(美國Sata Cruz Biotechnology公司)，甲苯胺藍染液、蘇木素染液(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 主要儀器

離心機(德國Eppendorf公司，5417R)，組織脫水機(德國LEICA公司，TP1020)，輪轉式切片(德國LEICA公司，RM2135)，光學顯微鏡(日本Olympus，BH-20)，紫外分光光度計(美國Beckman公司，DU 800)，熒光定量PCR儀器(美國BIO-RED公司，CFX96)。

1.4 藥物制備及給藥方法

由于OPG-/-小鼠為轉基因小鼠，耐受性較差，本實驗給藥周期共3個月，周期較長，故采用含藥飼料給藥。

健腰密骨片由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院藥劑科提供(炙黃芪15 g，川芎12 g，丹參9 g，秦艽12 g，蛇床子15 g，女貞子12 g，淫羊藿12 g)。含藥飼料按照文獻[9]制備，按照小鼠與人的體型系數換算等效劑量，每只小鼠按5 g/d計算，共10只，90 d共需4 500 g，考慮動物進食中的損耗，按5 000 g飼料制作。中藥共4付煎成水煎劑，濃縮至500 mL，加入到5 000 g飼料中，做成含藥飼料。動物2～3只/籠，每2 d添加1次含藥飼料，持續(xù)90 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

給藥結束后，獲得各組小鼠頸椎，其中各組5只固定進行組織學檢測，5只放于液氮固定以備后續(xù)RNA提取。組織學檢測的標本在中性固定液24 h后，PBS清洗5 min×3次，10%EDTA進行脫鈣，每3 d更換1次脫鈣液，脫鈣4周。標本脫水及石蠟包埋。冠狀位連續(xù)切片，厚度為7 μm，以椎間盤髓核最大時為中央部位的標準，取前后連續(xù)切片進行組織學檢測。所有組織染色及RNA抽提取頸5-6椎間盤，用于RNA檢測的標本采用Trizol法提取，方法具體如下。

1)甲苯胺藍染色：組織常規(guī)脫蠟復水，甲苯胺藍染液15 s，蒸餾水洗，常規(guī)脫水透明及封片。2)免疫組化染色方法：組織常規(guī)脫蠟復水，3% H2O2孵育10 min，PBS浸洗2 min×3次，蛋白酶K進行抗原修復15 min，PBS浸洗5 min×3次，滴入5%BSA封閉1 h。吸走BSA直分別滴加兔多克隆抗Ⅹ、Ⅱ、I型膠原一抗，4 ℃過夜。PBS浸洗5 min×3次，加入二抗，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗5 min×3次，抗生物蛋白鏈菌素-HRP，37 ℃孵育10 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木精染色2 min，鹽酸乙醇分化5 s，氨水返藍，脫水透明及封片。其中棕黃色著色為陽性表達。3)實時熒光定量RT-PCR方法：將椎間盤組織放入研缽中，按照Trizol法[9]提取RNA，隨后按照Takara 逆轉錄試劑盒說明書進行RNA的逆轉錄，反轉錄1 μg，體系為20 μL，條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，結束后加入80 μL ddH2O將逆轉錄的DNA進行稀釋。取各組樣品cDNA 2 μL，按照熒光定量PCR試劑說明配置20 μL反應體系進行qPCR，β-actin作為內參。條件為95 ℃ 5 min預變性，進入循環(huán)，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)，進入延伸，72 ℃ 30 s，4 ℃ 保持。程序結束后進行數值的計算與分析，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 甲苯胺藍染色

與WT小鼠比較，OPG-/-小鼠椎間盤軟骨終板中出現部分缺損，缺損的部位被病理性新骨所代替；與OPG-/-小鼠相比，健腰密骨片組椎間盤軟骨終板中的缺損和異位骨化明顯減輕，見圖1。

圖1 各組椎間盤甲苯胺藍染色(×100)

2.2 椎間盤中Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型膠原的表達

與WT小鼠比較，OPG-/-小鼠椎間盤Ⅱ型膠原表達明顯減少，Ⅰ型膠原和Ⅹ型膠原表達增加；與OPG-/-小鼠相比，健腰密骨片組的Ⅱ型膠原蛋白表達增加，Ⅰ型膠原和Ⅹ型膠原蛋白表達降低，見圖2。

圖2 各組椎間盤軟骨終板Ⅱ、Ⅹ、Ⅰ型膠原蛋白的表達(×400)

2.3 椎間盤組織中Aggrecan及Col10α1的表達

與WT小鼠比較，OPG-/-小鼠椎間盤中Aggrecan的水平明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，反之，Col10α1表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與OPG-/-組相比，健腰密骨片上調OPG-/-小鼠椎間盤組織 Aggrecan的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；下調Col10α1表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組椎間盤組織中Aggrecan 和Col10α1 mRNA表達

3 討論

健腰密骨片是上海市名中醫(yī)施杞教授治療骨質疏松癥的經驗方，由炙黃芪、川芎、秦艽、丹參、淫羊藿、補骨脂、蛇床子7味中藥組成。諸藥配伍，共奏補腎填精、強筋壯骨、益氣化瘀之效。課題組前期實驗研究證明該方明顯提高小鼠椎體骨量，促進骨髓間充質干細胞向成骨分化，促進骨形成[10]。原發(fā)骨質疏松癥和椎間盤退變性疾病的主要中醫(yī)病機為腎虛，基于中醫(yī)“腎主骨”理論和“異病同治”的原則，OPG-/-小鼠出現的椎間盤退變同樣可以補腎論治。因此筆者采用健腰密骨片來治療OPG-/-小鼠出現的椎間盤退變，觀察該方是否可以代償OPG延緩OPG-/-小鼠的椎間盤退變，結果顯示與WT組相比，甲苯胺藍染色發(fā)現OPG-/-小鼠軟骨終板部位出現一定比例的軟骨缺失，而缺失的部位又被病理性新骨所替代。軟骨終板是椎間盤的組成結構之一，對維持椎間盤的正常生理功能具有重要作用[11]，其表面分布有細小孔隙，相鄰椎體內血管的營養(yǎng)物質可以通過軟骨終板孔隙彌散至髓核內層及纖維環(huán)，同時髓核及纖維環(huán)分泌的一些因子及代謝產物可經軟骨終板通道運輸出去，完成椎間盤的代謝[12]，軟骨終板結構改變將影響椎間盤的營養(yǎng)供應，最終引起椎間盤退變。健腰密骨片組椎間盤軟骨終板部位的骨化和缺損明顯減少，說明健腰密骨片對維持OPG-/-小鼠椎間盤軟骨終板的完整性具有一定的作用。

椎間盤軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原及蛋白多糖(Aggrecan)，Ⅱ型膠原呈絲狀的膠原蛋白纖維可與Aggrecan相互交織成網狀纖維結構，維持椎間盤的彈性及力學性能[13]，當軟骨細胞外基質Ⅱ型膠原及Aggrecan過度丟失，膠原纖維網破壞，膠原蛋白的組成將由Ⅱ型膠原轉變?yōu)棰裥湍z原[14]。研究發(fā)現椎間盤退變過程中，軟骨細胞內Ⅱ型膠原表達下降及Ⅰ型膠原合成的增加將打破椎間盤內膠原組成的比例平衡，導致椎間盤原有的生理功能下降[15]。Ⅹ型膠原是肥大軟骨細胞(終末端軟骨細胞)的標志性分子，免疫組化結果發(fā)現健腰密骨片能夠促進OPG-/-小鼠椎間盤軟骨終板Ⅱ型膠原蛋白的表達，下調Ⅹ、Ⅰ型膠原蛋白表達。另一方面，健腰密骨片促進OPG-/-小鼠椎間盤組織Aggrecan mRNA的表達，抑制Col10α1 mRNA表達，說明健腰密骨片具有促進軟骨細胞基質分泌、抑制軟骨細胞肥大、改善軟骨細胞代謝的作用。

以上研究提示健腰密骨片可能通過干預軟骨細胞的基質代謝延緩OPG-/-小鼠出現的椎間盤退變，但是具體通過何種途徑代償OPG并不清楚，后續(xù)將進一步深入研究。以上結果提示健腰密骨片不僅可以治療骨質疏松癥，還可以延緩椎間盤退變，為臨床應用該方治療椎間盤退變性疾病提供實驗數據，還提示補腎法是治療骨代謝與脊柱退行性疾病的重要方法。