太白通絡(luò)凝膠膏對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎炎性因子及關(guān)節(jié)軟骨的影響

李哲 柳源 李彥民 楊鋒，△

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)又稱膝退行性關(guān)節(jié)炎，是以膝關(guān)節(jié)軟骨破壞及滑膜病變等為主要病變特征的慢性疾病，其中異常炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織發(fā)生退行性變化的重要原因之一[1-2]。相關(guān)研究顯示[3-7]中醫(yī)藥對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療已取得大量成果。然而由于中藥成分比較復(fù)雜，相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。

太白通絡(luò)凝膠膏是陜西省名中醫(yī)李彥民教授的經(jīng)驗(yàn)方，采用太白山道地“七藥”鐵牛七30 g、制南星10 g、細(xì)辛10 g、川牛膝15 g、秦椒10 g等五味藥組成并結(jié)合現(xiàn)代制劑工藝制成的外用制劑，初步臨床研究療效顯著[8-9]。本次研究通過(guò)觀察太白通絡(luò)凝膠膏對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中TGF-β1、MMP-13、Col-Ⅱ及關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β及TNF-α表達(dá)的影響，來(lái)研究太白通絡(luò)凝膠膏治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理，為太白通絡(luò)凝膠膏在臨床應(yīng)用及推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只雌雄各半新西蘭白兔，SPF級(jí)，3～4個(gè)月齡，體質(zhì)量1.8～2.0 kg(西安易諾谷生物科技有限公司供給，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證號(hào)為SCXK(陜)2017-002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

太白通絡(luò)凝膠膏由鐵牛七30 g、制南星10 g、細(xì)辛10 g、川牛膝15 g、秦椒10 g五味中藥組成，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備而成，雙氯酚酸二乙胺乳膠劑(北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990291)、蘇木精-伊紅(HE)及甲苯胺藍(lán)(TB)(百奧萊博生物科技有限公司)、兔IgG-免疫組化試劑盒(博士德生物公司)、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、檸檬酸鹽緩沖劑(科昊生物工程有限責(zé)任公司)、MMP-13、TGF-β1、Col-Ⅱ試劑盒(Proteintech)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

外科手術(shù)器械(手術(shù)剪、手術(shù)刀、止血鉗、縫合針、組織鑷、無(wú)菌敷料等)、冰凍切片機(jī)(湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó))、生物組織包埋機(jī)(天津愛(ài)華醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))、光學(xué)顯微鏡(Leica 儀器有限公司，德國(guó))、恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司，中國(guó))、高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司，中國(guó))。

1.4 方法

1.4.1兔模型制備與處理 將40只新西蘭白兔，用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組(每組10只)，A組為空白組、B組為模型組、C組為對(duì)照組(玻璃酸鈉干預(yù)組)、D組為實(shí)驗(yàn)組(太白通絡(luò)凝膠膏干預(yù)組)。除空白組外，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和模型組3組實(shí)驗(yàn)兔均采用改良Hulth法[1]構(gòu)建兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。

待造模成功后，對(duì)兔右側(cè)下肢關(guān)節(jié)周?chē)M(jìn)行脫毛處理，空白組給予同等規(guī)格的醫(yī)用膠布敷貼，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、模型組分別給予太白通絡(luò)凝膠膏、雙氯酚酸二乙胺乳膠劑、醫(yī)用膠布，1次/d，8 h/次，連續(xù)4周。

1.4.2標(biāo)本制備及觀察 在給藥結(jié)束后，采用空氣栓塞法處死4組實(shí)驗(yàn)兔。切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，肉眼仔細(xì)觀察關(guān)節(jié)軟骨表面的形態(tài)變化及軟骨厚度、色澤等大體變化。實(shí)驗(yàn)兔處死后，在切開(kāi)兔膝關(guān)節(jié)之前，實(shí)施膝關(guān)節(jié)穿刺術(shù)，在右膝關(guān)節(jié)周?chē)玫夥竞?，首先向關(guān)節(jié)腔注射1.0 mL玻璃酸鈉注射液，充分活動(dòng)膝關(guān)節(jié)并抽取關(guān)節(jié)液，立刻經(jīng)4 ℃、轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心，取其上清液置入-20 ℃冰柜內(nèi)保存待用。使用ELISA檢測(cè)關(guān)節(jié)液IL-6、IL-1β、TNF-α含量。關(guān)節(jié)液采集完畢后，取3 mm×3 mm、厚約0.5 mm的股骨髁關(guān)節(jié)面軟骨組織，放入10%中性組織固定液中浸泡24 h，清水沖洗后，浸入緩沖液脫鈣20 d，再進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋和切片，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)染色。

關(guān)節(jié)液采集完畢后，切開(kāi)兔右膝關(guān)節(jié)囊，充分暴露膝關(guān)節(jié)，觀察關(guān)節(jié)面軟骨色澤、光滑度、缺損等大體變化。按Pelletier標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行評(píng)分，在光鏡下觀察HE染色、TB染色后的切片，觀察關(guān)節(jié)軟骨變化，參考Mankin’s評(píng)分[11]評(píng)估兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損嚴(yán)重程度，評(píng)分越高表示軟骨缺損程度越嚴(yán)重。用ELISA方法測(cè)量關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平。用免疫組化法測(cè)量關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13、TGF-β1、Col-Ⅱ表達(dá)水平，在光鏡下觀察、攝圖，使用Mage-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，計(jì)算視野內(nèi)所有選定陽(yáng)性細(xì)胞的平均反應(yīng)強(qiáng)度及平均光密度(AOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有造模動(dòng)物切口愈合良好，無(wú)兔子死亡，新西蘭兔模型均單腿跛行。在造模后連續(xù)驅(qū)趕兔活動(dòng)4周，隨機(jī)從各組選出5只兔子行雙膝關(guān)節(jié)正側(cè)位DR?？瞻捉M兔雙膝關(guān)節(jié)正側(cè)位DR提示左右膝關(guān)節(jié)未見(jiàn)畸形，關(guān)節(jié)面光整，未見(jiàn)骨贅物，關(guān)節(jié)間隙未見(jiàn)狹窄。模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組雙膝關(guān)節(jié)正側(cè)位DR提示右膝關(guān)節(jié)呈內(nèi)翻畸形，關(guān)節(jié)間隙狹窄，關(guān)節(jié)周?chē)琴樏黠@；左膝關(guān)節(jié)未見(jiàn)明顯異常，見(jiàn)圖1。

圖1 兔膝關(guān)節(jié)正側(cè)位DR片

2.2 關(guān)節(jié)軟骨改變大體觀察

按照Pelletier標(biāo)準(zhǔn)[10]評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1及圖2，空白組大體觀察下其右膝關(guān)節(jié)表面光滑，有彈性，淺藍(lán)色，半透明，無(wú)裂紋、缺損及軟化；模型組關(guān)節(jié)軟骨表面大多呈黃色，斑片狀或廣泛性粗糙、糜爛，甚至出現(xiàn)裂紋、缺損及軟化，失去彈性；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨的病理變化肉眼觀察基本相同，表面大多呈黃色，斑片狀或廣泛性略顯粗糙，未見(jiàn)裂紋或缺損。

表1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨面大體Pelletier評(píng)分(例)

圖2 兔膝關(guān)節(jié)大體觀察

2.3 軟骨切片光鏡下組織病理學(xué)變化

HE及TB染色結(jié)果均顯示：A組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，輪廓清晰，無(wú)裂隙或缺損，四層結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整染色后軟骨層呈深藍(lán)色，鈣化層呈淡藍(lán)色，軟骨下骨呈藍(lán)紫色；B組關(guān)節(jié)軟骨層明顯缺損、變薄，部分區(qū)域軟骨全層喪失，切線層嚴(yán)重破壞，呈斑片狀或廣泛性碎裂或缺失，細(xì)胞減少，大量簇聚，潮線破壞；C組關(guān)節(jié)軟骨層次基本完整，切線層不規(guī)則，染色不均勻，細(xì)胞數(shù)量減少，損傷程度明顯好于B組，軟骨層輕度缺損，部分有裂隙，潮線尚完整；D組關(guān)節(jié)軟骨層，切線層軟骨細(xì)胞部分缺失，少許表淺裂隙，潮線尚完整，見(jiàn)圖3-圖4。

圖3 兔膝關(guān)節(jié)軟骨觀察(HE染色，×10)

圖4 兔膝關(guān)節(jié)軟骨觀察(TB染色，×10)

從Mankin’s[11]評(píng)分表結(jié)果顯示：各組評(píng)分結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與空白組評(píng)分相比較，模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；相比于模型組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組評(píng)分較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；但對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組兔右膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分

2.4 關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量檢測(cè)

模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組IL-6濃度與空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組濃度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)液中IL-6含量偏高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻捉M關(guān)節(jié)液中IL-1β表達(dá)水平明顯低于模型組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組濃度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)液中IL-1β含量偏高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組TNF-α濃度較空白組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組濃度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3及圖5。

表3 太白通絡(luò)凝膠膏對(duì)兔膝關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α的影響

圖5 兔膝關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)

2.5 關(guān)節(jié)軟骨中Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1表達(dá)水平

各組軟骨組織中Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1的平均光密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與空白組比較，模型組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞中MMP-13的平均光密度均值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；相比于對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，模型組MMP-13的平均光密度均值略高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4及圖6。

圖6 關(guān)節(jié)軟骨Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1細(xì)胞因子表達(dá)的AOD

表4 關(guān)節(jié)軟骨Col-Ⅱ、MMP-13、TGF-β1表達(dá)的平均光密度

光鏡下觀察顯示：空白組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中可見(jiàn)少量MMP-13表達(dá)；與空白組比較，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-13呈高表達(dá)狀態(tài)；相比于其他三組，模型組軟骨中表達(dá)MMP-13的軟骨細(xì)胞數(shù)量最多，見(jiàn)圖7。空白組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Col-Ⅱ、TGF-β1呈高表達(dá)水平；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的軟骨細(xì)胞中Col-Ⅱ、TGF-β1含量低于空白組，但高于模型組，見(jiàn)圖8-圖9。

圖7 MMP-13免疫組化表達(dá)(×40)

圖8 TGF-β1免疫組化表達(dá)(×40)

圖9 Col-Ⅱ免疫組化表達(dá)(×40)

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)與外傷、炎癥、衰老、代謝和免疫等諸多因素有關(guān)，但其確切發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)，KOA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡是造成關(guān)節(jié)軟骨變性的重要原因之一，其中炎性因子及軟骨代謝相關(guān)細(xì)胞因子在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[12-13]。目前，中醫(yī)藥治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的主要手段膏藥外敷以其簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，作用直接、療效卓著的特點(diǎn)在中醫(yī)外治法中占有非常重要的地位[14-15]。太白通絡(luò)凝膠膏以名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)為指導(dǎo)，辨證與辨病相結(jié)合，參考對(duì)骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)藥研究文獻(xiàn)，提出“通絡(luò)除痹”的中醫(yī)治療原則，并根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，自擬太白通絡(luò)方治療骨關(guān)節(jié)炎，全方由太白山道地草藥鐵牛七30 g、制南星10 g、細(xì)辛10 g、川牛膝15 g、秦椒10 g五味中藥組成。臨床應(yīng)用證實(shí)，太白通絡(luò)凝膠膏對(duì)骨關(guān)節(jié)炎等退行性骨關(guān)節(jié)疾病臨床療效顯著[9]。本研究通過(guò)構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎兔模型，證實(shí)了太白通絡(luò)凝膠膏能夠降低兔模型關(guān)節(jié)液中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平，以起到治療作用。

骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要細(xì)胞病變過(guò)程以軟骨細(xì)胞凋亡為主，其中MMP/TIMP-1動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)可能起著決定作用[16]。關(guān)節(jié)軟骨在代謝方面MMPs起著重要作用[17]，而MMP-13則是降解膠原的主要酶，其作用最強(qiáng)[18]。上述MMPs不能單獨(dú)對(duì)軟骨的破壞起作用，而是相互協(xié)同產(chǎn)生作用。MMP-13可裂解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原及膠原溶解后初始產(chǎn)物，而關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一是Ⅱ型膠原，其次為蛋白聚糖，Ⅱ型膠原遭到降解和破壞后，會(huì)導(dǎo)致軟骨支架結(jié)構(gòu)的崩塌[19]。TGF-β1促進(jìn)骨間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，并促進(jìn)Ⅰ型膠原、骨基質(zhì)蛋白、蛋白聚糖等軟骨細(xì)胞基質(zhì)主要成分的合成[20]。TGF-β1可以抑制IL-1對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖的分解且抑制MMP的產(chǎn)生，從而阻止MMP對(duì)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的破壞[21-22]。Col-Ⅱ代謝的異常將會(huì)造成軟骨基質(zhì)的降解，因此Col-Ⅱ可以作為衡量軟骨細(xì)胞分化異常和損傷的重要依據(jù)。

早期對(duì)太白通絡(luò)凝膠膏的研究以臨床療效研究為主，并未對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)證明太白通絡(luò)凝膠膏能夠調(diào)控兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中凋亡抑制因子MMP-13的表達(dá)水平，從而抑制IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的凋亡，其抑制作用與太白通絡(luò)凝膠膏組成方藥的主要成分有關(guān)。太白通絡(luò)凝膠膏組成方藥為太白山道地藥材，其中鐵牛七(別名八百棒、雪上一枝蒿、鐵棒錘、三轉(zhuǎn)半)為陜西常用道地藥材，其性熱，味辛、苦，有大毒，具有活血祛瘀、祛風(fēng)除濕、止痛消腫、興奮精神、消炎鎮(zhèn)痛等功效。天南星味苦辛，性溫，歸肺、肝、脾經(jīng)，功能消腫鎮(zhèn)痛，燥濕化痰，祛風(fēng)定驚，消痞散結(jié)。細(xì)辛具有祛風(fēng)散寒、止痛通竅、止咳平喘、通利血脈的功效，川牛膝具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋、催產(chǎn)下胎之效。又因川牛膝活血化瘀能力強(qiáng)于懷牛膝，故此方中用川牛膝而非懷牛膝以期獲得活血化瘀兼補(bǔ)肝腎的效果。秦椒現(xiàn)多稱為花椒，具有除寒濕痹痛、堅(jiān)齒發(fā)、明目之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)花椒還具有鎮(zhèn)痛作用，可能與花椒中所含茵芋堿有關(guān)[23]。取鐵牛七散寒除濕、祛瘀止痛的作用，是為君藥；制南星燥濕化痰、散結(jié)消腫為臣藥，細(xì)辛、秦椒散寒止痛為佐藥，川牛膝活血通絡(luò)、引藥直達(dá)病所為使藥，共奏散寒除濕、通絡(luò)止痛之功。在臨床使用中太白貼膏治療膝骨關(guān)節(jié)炎在緩解疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能、改善中醫(yī)證候、提高患者生活質(zhì)量等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：外敷太白通絡(luò)凝膠膏治療兔KOA機(jī)理是通過(guò)降低關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α，減緩關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)軟骨的損傷，并且減少M(fèi)MP-13表達(dá)，促進(jìn)Col-Ⅱ、TGF-β的分泌，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的破壞，延緩關(guān)節(jié)軟骨損傷，起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用，為太白通絡(luò)凝膠膏在臨床應(yīng)用及推廣提供了理論依據(jù)及藥效學(xué)基礎(chǔ)。