基于CRISPR/Cas原理的轉基因產品檢測技術研究進展

謝宇宙， 付偉， 閆超杰， 王智， 朱鵬宇， 任永超， 張永， 相寧*

1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100176；2.中華人民共和國錦州海關，遼寧錦州121013；3.貴州省黔南布依族苗族自治州檢驗檢測院，貴州都勻558000

轉基因產品檢測技術是轉基因貿易安全和有序進行的重要保障。轉基因產品核酸分子檢測技術是轉基因產品檢測最為直接、有效的方法。轉基因產品核酸分子檢測技術的不斷創(chuàng)新與進步是轉基因產品安全監(jiān)管的重要支撐。目前，轉基因產品核酸檢測技術主要分為PCR 檢測技術與環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術兩大類，這兩類技術存在依賴儀器、操作復雜、檢測時間較長等局限，一定程度上阻礙了口岸對于轉基因產品的監(jiān)管工作。因此，開發(fā)出無需儀器、操作簡單、檢測時間短、靈敏度高、特異性強的轉基因產品檢測技術有利于轉基因產品監(jiān)管工作質量的進一步提升。

基因組編輯技術是近年來迅速發(fā)展的一類遺傳修飾技術，可以實現(xiàn)基因敲除、基因敲入和引入精細突變[1]，而基因編輯技術的代表技術——CRISPR/Cas 技術，自問世以來，掀起了生物學界的一場技術革命，對生物技術發(fā)展產生了深遠的影響。CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細菌體內的獲得性免疫防御系統(tǒng)，用來對抗入侵細菌的外源DNA、質粒和噬菌體[2]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)除了被應用于基因編輯領域，也逐漸被應用于核酸分子檢測領域，不斷展現(xiàn)出高特異性、高靈敏度、無需儀器、快速準確等突出優(yōu)勢[3]。本文總結了近年來CRISPR/Cas 系統(tǒng)在檢測領域中的研究進展，并介紹了轉基因產品檢測技術現(xiàn)狀，同時對CRISPR/Cas 系統(tǒng)在轉基因產品檢測上的前景加以展望，旨在為相關人員將CRISPR/Cas 技術應用于轉基因檢測領域而進一步開發(fā)出適合于口岸現(xiàn)場快速檢測的新型轉基因產品核酸檢測技術提供參考。

1 CRISPR/Cas檢測技術研究進展

細菌體內的CRISPR/Cas 系統(tǒng)在對抗外源DNA、質粒和噬菌體等入侵時，首先將入侵者DNA 整合到自身CRISPR 序列中，然后將CRISPR序列轉錄成長 RNA 前體（pre-crispr RNA，pre-crRNA），并進一步切割成短RNA（CRISPR RNA，crRNA），最后形成導向 RNA（single-guide RNA，sgRNA）[4]。sgRNA 能夠在細菌下次受到入侵時識別入侵者的核酸，并引導Cas 核酸酶切割入侵者的核酸[5]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為兩類，第1類CRISPR/Cas 系統(tǒng)Cas 核酸酶由多個Cas 蛋白組成，分為Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ3 種亞型，第2 類CRISPR/Cas系統(tǒng)Cas 核酸酶為單個Cas 蛋白，分為Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ3 種亞型[6]。張鋒團隊于2015 年發(fā)現(xiàn)了3 個新的2類效應蛋白（C2c1、C2c2 和 C2c3）[7]，同年發(fā)現(xiàn)C2c2-crRNA 在匹配到靶RNA 后，除剪切匹配的靶RNA 外，還能非特異性地剪切環(huán)境中的單鏈RNA[3]，這個發(fā)現(xiàn)為其他研究人員利用Cas 蛋白體外非特異性切割核酸特性進行檢測提供了基礎[8]。截至目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)里有三類單一效應蛋白（Cas12、Cas13 和 Cas14）被報道具有非特異性切割核酸特性，并被用于檢測，加上原本的Cas9 蛋白，目前已經有4 種Cas 蛋白被用于檢測領域。

1.1 基于Cas9的檢測技術進展

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)屬于 2 類 Cas 系統(tǒng)Ⅱ型，能夠由RNA 引導精準切割特定序列的DNA。利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特異性切割的特性，可以作為核酸擴增反應的“開關”，并進一步實現(xiàn)對靶標核酸序列的檢測。Pardee 等[9]于2016 年首次將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)運用到檢測中，他們將等溫toehold 生物傳感技術與CRISPR/Cas9 結合，通過觀察紙盤顏色的變化可以實現(xiàn)在3 h 內對寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）美 洲 株 和 非 洲 株 的 分型（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9體外分型寨卡病毒流程圖[9]Fig.1 Flow chart of CRISPR/Cas9 in vitro typing of Zika virus[9]

在邁出第一步后，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與其他技術結合，被更廣泛的用于檢測領域。CRISDA（CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplifi cation method）技術是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在分子檢測領域的又一進步，該技術利用CRISPR/Cas系統(tǒng)效應蛋白Cas9在與靶核酸分子結合過程中獨特的構象變化，作為鏈取代等溫擴增反應的“開關”，高效啟動針對靶核酸分子的指數(shù)倍擴增，成功檢測出人基因組中乳腺癌相關的單核苷酸位點突變，并在野生型大豆中成功檢測出萬分之三的轉基因大豆。相比于傳統(tǒng)PCR 和其他等溫擴增檢測技術，該技術有以下幾大優(yōu)勢：①能夠實現(xiàn)aM（10-18mol·L-1）水平的高靈敏度；②達到了區(qū)分單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的特異性；③其引物設計簡單，對新位點的檢測反應體系開發(fā)迅速；④在90 min 內無需儀器、無需溫度變化即可完成整個檢測過程[10]。Huang 等[11]也將 CRISPR/Cas9基因編輯技術與等溫擴增技術相結合，開發(fā)了CAS-EXPAR（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction）技術，成功用于達到單堿基分辨率的DNA 甲基化和單核細胞增生李斯特菌總RNA 檢測。除核酸檢測技術外，將CRISPR/dCas9 系統(tǒng)和石墨烯膜場效應晶體管技術結合起來也可用于檢測。以石墨烯膜為基礎的晶體管上載有dCas9（只有識別功能，沒有剪切功能）和sgRNA 的復合體，當樣品滴加到膜上，一旦dCas9-sgRNA 識別并結合相應的靶DNA 分子，晶體管就發(fā)出一個電信號，不需要擴增樣本DNA 便能夠實現(xiàn)檢測，但檢測過程需要特定的儀器，無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測[12]。

1.2 基于Cas13的檢測技術進展

Cas13a 蛋白屬于 2 類系統(tǒng)Ⅵ型，由 RNA 引導并切割RNA，由張鋒團隊于2015 年發(fā)現(xiàn)，當時被命名為C2c2 蛋白[7]。張鋒團隊于2016 年發(fā)現(xiàn)，C2c2/Cas13a 蛋白在crRNA 的指導下匹配到靶標RNA 后，不僅可以切割靶標RNA，還可以非特異性地剪切環(huán)境中的其他單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）（圖 2）[8]。Doudna 團隊于 2016 年首次將C2c2/Cas13a 蛋白非特異性切割RNA 特性與熒光報告RNA 結合，利用C2c2/Cas13a 蛋白在匹配到靶標RNA 后非特異性切割環(huán)境中的熒光報告RNA 分子進而釋放出熒光信號，通過對熒光信號的觀察實現(xiàn)對靶標RNA 的檢測，并采用該技術成功檢測了噬菌體RNA，靈敏度能夠達到0.01 nM（10-9mol·L-1）[8]。

圖2 Cas13a蛋白非特異性切割RNA模型[8]Fig.2 Cas13a protein non-specific cleavage of RNA model[8]

張鋒團隊于2017 年將Cas13a 系統(tǒng)非特異性切割核酸原理與重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術相結合設計了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）技術，該技術首先采用RPA 擴增DNA 或逆轉錄重組酶聚合酶擴增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA）技術擴增RNA，然后對DNA 產物進行轉錄，最后采用Cas13a-crRNA與熒光報告RNA檢測轉錄得到的RNA（圖3），并利用SHERLOCK 技術成功檢測出了待測尿液樣本中濃度低至每微升含單一拷貝的寨卡病毒[13]。通過引入RPA 技術，SHERLOCK 技術實現(xiàn)了核酸的等溫擴增，同時大幅提高了靈敏度，最低能夠檢測到aM 水平的核酸。隨后，張鋒團隊進一步改善了SHERLOCK 技術，在多重化方面，他們挑選了來自2個不同菌株的Cas13a 和來自2 個不同菌株的Cas13b，構建出一個單管體系擁有4 個通道的多重分析方法。在定量化方面，他們將引物系列稀釋，找到了合適的引物濃度（240 nmol·L-1），改進后的 SHERLOCK技術可以實現(xiàn)低至2 aM 的靶標核酸定量檢測。在去熒光方面，張鋒團隊將金標免疫層析技術與SHERLOCK 技術結合，實現(xiàn)了通過試紙條顏色的變化來獲取結果[14]。Myhrvold 等[15]在 SHERLOCK技術的基礎上設計了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）技術，該技術先通過加熱滅活了核酸酶與病毒，然后通過熒光顯色或金標免疫層析的顏色變化實現(xiàn)了對患者的血清、唾液或尿樣中的塞卡病毒RNA 的高靈敏度與即時檢測。在新冠病毒爆發(fā)后，張鋒團隊設計了針對新冠病毒的檢測技術STOPCovid.V2，該技術采用LAMP 技術擴增RNA，并找到了在LAMP 溫度下仍能保持足夠切割活性的Aap-Cas12b（Alicyclobacillus acidophilus Cas12b）酶，使得整個反應能在同一溫度（60 ℃）、同一管內完成，檢測下限低至100 個新冠病毒RNA 分子，靈敏度達到了93.1%，特異性達到了98.5%，整個流程只需15～45 min[16]。

圖3 SHERLOCK檢測原理[17]Fig.3 SHERLOCK detection principle[17]

1.3 基于Cas12的檢測技術進展

Cas12a（舊稱 Cpf1）屬于 2 類系統(tǒng)Ⅴ型，由RNA 引導并負責切割單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA），由張鋒團隊于 2015 年發(fā)現(xiàn)[18]。Doudna 團隊于2018 年發(fā)現(xiàn)了Cas12a 非特異性切割活性，Cas12a-crRNA 復合體在識別單鏈或雙鏈靶標DNA 后，能夠剪切靶DNA 和非特異性地剪切環(huán)境中的ssDNA。隨后，該團隊將RPA 技術與Cas12a 相結合，設計了新的CRISPR/Cas 檢測技術，命名為DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）。與 SHERLOCK 相比，DETECTR 減少了從擴增后的DNA 產物轉錄到RNA這一步，直接采用RPA 等溫擴增待測DNA，然后將擴增產物與Cas12a-crRNA 復合體混合，識別并匹配靶標DNA，并啟動Cas12a 的非特異核酸酶活性，對反應體系中的熒光報告DNA 探針進行切割，釋放出熒光信號，進而實現(xiàn)對靶標DNA 的檢測（圖 4）[17]。DETECTR 技術同時能夠達到 aM 水平的靈敏度和小于等于7 個堿基的特異性，Doudna 團隊采用DETECTR 技術在1 h 內便準確地檢測出了臨床患者樣本中的HPV16和HPV18并成功對其進行分型[19]。

圖4 DETECTR檢測原理[17]Fig.4 DETECTR detection principle[17]

與此同時，Li 等[20]也開發(fā)了與RPA 技術結合的Cas12a 檢測方法，命名為HOLMES（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system），該方法可靈敏、特異、快速的實現(xiàn)SNP 分型、DNA 病毒和 RNA 病毒的檢測。Li 等[21]發(fā)現(xiàn) 2 類Ⅴ型的Cas12b（C2c1）蛋白也具有非特異性切割能力，通過將其與LAMP 技術相結合，開發(fā)了HOLMESv2檢測技術，統(tǒng)一了二者的反應溫度，實現(xiàn)了快速一體化檢測。Broughton等[22]將逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）技術、側向流動檢測技術與DETECTR 技術結合，開發(fā)出采用試紙條從呼吸拭子RNA 提取物中檢測新冠病毒的方法，可在40 min內完成整個流程，特異性達到了95%，為當前基于實驗室儀器的熒光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）新冠病毒檢測方法提供了更為直觀、快速的替代方法。

1.4 基于Cas14的檢測技術進展

Doudna 團隊在Cas12a 之后找到的新的Cas蛋白——Cas14，屬于2 類系統(tǒng)Ⅴ型，靶向ssDNA，在激活后剪切靶ssDNA 和非特異性地剪切環(huán)境中的ssDNA。Cas14 蛋白的大小大約只有其他2類CRISPR 效應蛋白的一半，靶標序列沒有前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的限制，所以可以靶向任何序列，并且對識別序列中間的堿基的要求很嚴格，有1 個錯配就不能結合，特異性能達到單堿基。Doudna 團隊仿照DETECTR 技術設計了 Cas14-DETECTR 檢測技術，但由于 Cas14-sgRNA 只識別 ssDNA，因此在 RPA 擴增時，需要對引物進行修飾，降解雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）中的一條鏈，得到ssDNA。Doudna 團隊通過從藍眼和棕眼人類的唾液中提取DNA 并擴增，然后采用Cas14-DETECTR檢測技術成功區(qū)分出藍眼和棕眼的基因型，特異性達到單堿基（控制2種顏色眼睛的基因序列中只有1個堿基差異），同時實現(xiàn)了aM水平的靈敏度[23]。

綜上所述，基于不同效應蛋白研發(fā)的CRISPR/Cas 檢測技術具有不同特性，具體見表1，可在實際應用中根據(jù)需求進行選擇。

表1 CRISPR/Cas檢測技術比較分析Table 1 Comparative analysis of CRISPR/Cas detection technologies

2 CRISPR/Cas 檢測技術在轉基因產品檢測上的應用進展

轉基因技術是指通過體外重組DNA 技術將外源基因轉入到生物體的細胞或組織中，由于導入基因的表達引起生物體性狀的可遺傳性修飾，從而使再生生物體獲得新的遺傳特性。截止到2019年，轉基因作物種植面積比1996年增加了約112 倍，累計種植面積達 27 億 hm2[24]。然而，隨著轉基因產品的大規(guī)模商業(yè)化，其對生態(tài)環(huán)境與人體健康的潛在風險尚存在疑問，因此需要對轉基因產品進行嚴格的監(jiān)管[25]。轉基因產品檢測技術是轉基因產品安全評價與管理的重要技術保障。

2.1 轉基因產品檢測技術現(xiàn)狀

轉基因產品檢測技術根據(jù)檢測對象的不同主要分為兩類，即針對外源核酸特定序列的檢測技術與針對外源蛋白的檢測技術。

針對外源核酸特定序列的檢測技術是檢測植物外源插入序列最直接、最有效的方法[26]，可分為PCR 檢測技術與LAMP 技術兩大類。PCR 檢測技術包括定性PCR 和定量PCR，定性PCR 中常用的有普通PCR、實時熒光定性PCR、巢式和半巢式PCR 與多重PCR[27]，定量PCR 中常用的有實時熒光定量PCR 與數(shù)字PCR[28]。PCR 檢測技術能夠實現(xiàn)轉基因產品的定性或定量檢測，具有特異性強、靈敏度高、簡便快速等優(yōu)點。LAMP 技術是Notomi等[29]在2000年開發(fā)的一種新型恒溫核酸擴增方法，其擴增過程不需要特殊儀器和溫度循環(huán)，且兼具成本低、特異性強、靈敏度高與產物易檢測等優(yōu)點，適合用于現(xiàn)場快速核酸檢測。

針對外源蛋白的檢測技術是檢測轉基因產品中外源蛋白表達情況的直接方法，其基本原理是將表達的外源蛋白作為抗原，利用其與抗體特異性結合以實現(xiàn)對轉基因產品快速檢測，主要包括蛋白免疫印跡雜交技術（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）與免疫試紙條檢測技術。相比于核酸檢測技術，針對外源蛋白的檢測技術可以更加直接的檢測外源蛋白的表達情況，其中，免疫試紙條技術還可以作為現(xiàn)場初篩技術，操作簡便、迅速，成本低廉[30]。

隨著轉基因技術的進一步商業(yè)化，轉基因產品檢測技術的研究與開發(fā)逐漸成為全球轉基因安全監(jiān)管和轉基因產品國際貿易的重要支撐。盡管目前針對核酸的檢測技術與針對外源蛋白的檢測技術被廣泛應用于轉基因產品檢測中，但這些技術都有自身的局限性。PCR檢測技術受到反應過程中溫度循環(huán)的限制，需要特定的儀器才可以完成檢測，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測[31]。LAMP技術引物設計十分復雜，并且對擴增產物處理不當容易造成DNA 污染，影響后續(xù)的實驗結果[32]。針對外源蛋白的檢測技術，除免疫試紙條技術外，均需要依賴特定的儀器，操作復雜，同樣難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。而免疫試紙條技術只能檢測轉基因產品中表達的外源蛋白，無法針對核酸，并且靈敏度較低，對于深加工的轉基因產品（如大豆油等），因其外源蛋白含量低、抗原性差，采用免疫試紙條技術檢測時的準確性較低[30]。因此，亟待開發(fā)出一種針對核酸的快速、高效、成本低廉的轉基因產品現(xiàn)場快速檢測技術，彌補當前轉基因產品檢測體系中現(xiàn)場快速檢測技術的不足。

2.2 CRISPR/Cas 技術在轉基因產品檢測上的應用

近幾年，CRISPR/Cas 技術在檢測領域中迅速發(fā)展，也被逐漸應用于轉基因產品檢測領域。Wu等[33]利用Cas12a 系統(tǒng)開發(fā)了一套針對CaMV35S啟動子的可視化檢測方法，該方法以轉基因大豆（RoundupReady?）粉中的CaMV35S 啟動子作為檢測靶標設計了相應的crRNA，首先通過LAMP 技術擴增靶序列，然后將CRISPR/Cas12a 熒光系統(tǒng)與擴增產物在37 ℃下混合5 min，在紫外光（254 nm）下就可以用肉眼清楚地識別出檢測結果，成功檢測到大豆粉中低至0.05%的轉基因含量。Zhang等[34]結合了Cas12a系統(tǒng)、濾紙條基因組提取技術、RPA 技術、側向層析檢測技術設計出針對水稻葉片Cry1C基因的檢測方法，該方法使用濾紙條制備基因組DNA，在體溫下通過RPA 擴增目標基因，使用Cas12a 檢測RPA 產物，并使用側向層析紙條讀取測試結果，可以實現(xiàn)無需儀器、常溫、30 min 內通過觀察側向層析試紙條的顏色變化完成對轉Cry1C基因水稻的鑒定。

轉基因產品檢測技術的不斷發(fā)展是保障轉基因產品貿易安全有序進行的重要支撐，新的轉基因產品檢測技術有利于進一步加強轉基因產品的監(jiān)管。傳統(tǒng)的轉基因產品現(xiàn)場快速檢測技術主要有LAMP 技術與免疫試紙條技術，這2 種現(xiàn)場快速檢測技術均有其局限性。CRISPR/Cas 檢測技術相比于LAMP 技術，只需設計出RPA 或LAMP引物與crRNA，技術開發(fā)過程更加簡單。相比于免疫試紙條技術，CRISPR/Cas 檢測技術以核酸為檢測靶標，擁有更高的特異性與靈敏度，針對核酸的檢測也更加直接、有效。

3 展望

目前，應用在轉基因產品檢測上的CRISPR/Cas 檢測技術主要是基于Cas12 蛋白，其特異性、靈敏度、便捷性得到了證明[33-34]。隨著CRISPR/Cas 檢測技術在轉基因產品檢測上的進一步應用，除了基于Cas12 蛋白的檢測技術，Cas9 蛋白、Cas13 蛋白、Cas14 蛋白等理論上都可以設計出相應的轉基因產品檢測技術。但是，相比于基于Cas13蛋白的檢測技術所使用的RNA 熒光報告基團，基于Cas12 蛋白的檢測技術使用的是DNA 熒光報告基團，更為穩(wěn)定，假陽性率較低，檢測結果更加可靠。此外，基于Cas12 蛋白的檢測技術的核酸擴增產物無需進行轉錄便可直接檢測，操作更加便捷。相比于基于Cas14 蛋白的檢測技術需要使用修飾的引物和T7 核酸外切酶進而生成ss-DNA 產物，基于Cas12 蛋白的檢測技術來說操作更加簡單。但由于CRISPR/Cas 檢測技術整個檢測過程都無需儀器，而只依據(jù)熒光反應或肉眼可見的顏色變化實現(xiàn)檢測目的，因此依據(jù)熒光值強弱或顏色變化難以實現(xiàn)轉基因產品的準確定量檢測。

總體來說，CRISPR/Cas 檢測技術應用于轉基因產品現(xiàn)場快速檢測時兼具以下優(yōu)點：①等溫擴增無需儀器，可以通過試紙條的顏色變化實現(xiàn)檢測；②檢測快速，整套檢測流程可在30 min以內完成；③操作簡便，普通工作者也可完成檢測；④成本低廉，一套CRISPR/Cas 檢測流程的成本約為4.1 美元[35]；⑤設計簡單，針對不同的檢測序列只需重新設計RPA 或LAMP 引物和crRNA 序列；⑥高特異性，crRNA 與靶DNA 完全匹配后才能激活Cas 蛋白的非特異性切割活性；⑦高靈敏度，檢測低限可達aM 水平。但目前CRISPR/Cas 檢測技術在轉基因產品現(xiàn)場快速檢測中的應用仍有一些局限性，如依賴核酸擴增和富集、靶標序列受PAM 序列限制、核酸提取純度低、Cas 蛋白的脫靶效應造成的假陽性等。但這些問題可以通過相應的改進措施來解決，如尋找Cas 蛋白的變體擴大PAM 序列識別范圍[36-37]、采用高保真Cas蛋白減少假陽性[38]、采用磁性顆粒純化DNA[39]等。

除了在轉基因產品現(xiàn)場快速檢測中應用前景廣闊，CRISPR/Cas 檢測技術同樣在基因編輯產品的檢測、轉化體特異性檢測以及轉內源基因的轉基因產品檢測中展現(xiàn)出了巨大的潛力。在基因編輯產品的檢測中，可以將基因編輯位點的特異性序列作為靶序列，設計相應的crRNA或sgRNA，若crRNA或sgRNA與特異性序列成功匹配則可啟動Cas 酶的核酸切割活性，進而實現(xiàn)基因編輯產品的檢測。在轉化體特異性檢測和轉內源基因的轉基因產品檢測中，也可根據(jù)外源基因以及內參照基因的特異性序列設計相應的crRNA 或sgRNA，若crRNA 或sgRNA 與特異性序列成功匹配即可啟動Cas 酶活性進而實現(xiàn)轉基因產品的特異性檢測。隨著CRISPR/Cas 檢測技術在轉基因產品現(xiàn)場快速檢測中的進一步應用，將會進一步促進轉基因產品檢測技術的發(fā)展。