UPLC-PDA同時測定肝復康丸中10個成分含量及主成分分析

王會品，王金梅

1.鄭州市第三人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南大學 藥學院，河南 鄭州 475000

肝復康丸是由五味子、太子參、白花蛇舌草3味中藥按2∶1∶1的處方比例制備而成的水蜜丸，收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第7冊，具有收斂、益氣、解毒、降谷丙轉氨酶的功效，用于急慢性肝炎、早期肝硬化和肝功能不良等癥[1]。五味子具有收斂固澀、生津止渴、補腎寧心的功效，臨床用于治療久咳虛喘、夢遺滑精、自汗盜汗、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥?，F(xiàn)代天然藥物化學、藥理學研究證明，木脂素類成分是五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化、抗腫瘤等作用[2]；太子參具有益氣健脾、生津潤肺的功效，其指標成分太子參環(huán)肽B具有抑制酪氨酸酶和黑色素產(chǎn)生的作用[3]；白花蛇舌草為臨床常用治療惡性腫瘤和各種炎癥的中藥，其黃酮類化學成分具有抗腫瘤、抗化學誘變的藥理活性[4]?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成分制劑》第7冊采用化學鑒別法定性分析肝復康丸，缺少定量分析指標，文獻報道僅限于采用高效液相色譜法(HPLC)測定肝復康丸中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素等成分的含量，指標成分單一、分析時間長[5-7]。超高效液相色譜法(UPLC)的快速發(fā)展為中藥及中成藥的分離分析提供了良好平臺。本研究選擇五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚、熊果酸及太子參環(huán)肽B作為指標成分，利用超高效液相色譜儀同時進行含量測定，為提高肝復康丸質(zhì)量控制水平及深入臨床研究提供參考。

1 材料

H-Class型超高效液相色譜儀(包括QSM二元溶劑管理器、二極管陣列檢測器、SM-FTN樣品管理器、CH-A型柱溫箱、Empower 3色譜工作站，Waters公司)；ABS-135S型電子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；KQ500D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司，功率：280 W，頻率：40 kHz)。

對照品蘆丁(批號：100080-201610，純度：92.6%)、齊墩果酸(批號：110709-201607，純度：91.7%)、槲皮素(批號：100081-201509，純度：98.6%)、山柰酚(批號：110861-201611，純度：95.5%)、熊果酸(批號：110742-201622，純度：94.7%)、五味子醇甲(批號：110857-201714，純度：99.9%)、五味子酯甲(批號：111529-201505，純度：95.3%)、五味子甲素(批號：110764-201513，純度：99.5%)、五味子乙素(批號：110765-201512，純度：99.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品太子參環(huán)肽B(批號：20170511，純度：99.0%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純(默克公司)；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

經(jīng)河南大學藥學院王金梅教授鑒定五味子(批號：20180918，產(chǎn)地：遼寧)為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Ball.的果實；太子參(批號：20170724，產(chǎn)地：山東)為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的塊根；白花蛇舌草(批號：20181107，產(chǎn)地：河南)為茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd.) Roxb.的帶根全草。

肝復康丸(規(guī)格：每10粒質(zhì)量1 g)購自藥店，共收集3個廠家13批的樣品，S1～S4為A公司生產(chǎn)(批號分別為20180704、20180925、20181119、20181206)，S5～S7為B公司生產(chǎn)(批號分別為20180525、20180712、20181223)，S8～S13為C公司生產(chǎn)(批號分別為201712381、201801125、201804271、201805169、201809332、201911274)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Ecilipse C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05% 磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～2.7 min，3%A；2.7～6.0 min，3.0%～20.5%A；6.0～16.9 min，20.5%～64.0%A；16.9～18.0 min，64.0%A；18.0～23.0 min，64.0%～3.0%A)；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：360 nm(0～3 min，蘆丁；9～10 min，槲皮素；11～12 min，山柰酚)、210 nm(3～9 min，齊墩果酸；12～23 min，熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)、203 nm(10～11 min，太子參環(huán)肽B)；柱溫：30 ℃；進樣量：3 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、五味子甲素、五味子乙素適量，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻；精密稱取對照品熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻。分別精密量取上述2種混合對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用60%乙醇定容，搖勻，即配制成含蘆丁57.1 μg·mL-1、齊墩果酸79.3 μg·mL-1、槲皮素48.7 μg·mL-1、太子參環(huán)肽B 32.4 μg·mL-1、山柰酚43.6 μg·mL-1、熊果酸137.9 μg·mL-1、五味子醇甲188.3 μg·mL-1、五味子酯甲112.7 μg·mL-1、五味子甲素48.2 μg·mL-1、五味子乙素39.6 μg·mL-1的混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取肝復康丸20丸，粉碎，稱取細粉約1.0 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加入60%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，室溫超聲處理(250 W，40 kHz)45 min，取出，放冷至室溫，用60%乙醇補足損失質(zhì)量，搖勻，15 200 r·min-1(離心半徑為10 cm)離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3陰性對照品溶液的制備 取五味子、太子參、白花蛇舌草，按肝復康丸處方比例制備缺五味子陰性對照品、缺太子參陰性對照品、缺白花蛇舌草陰性對照品，按2.2.2項下方法處理，即得相應的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下的供試品溶液、混合對照品溶液和陰性供試品溶液各3 μL，按2.1項下色譜條件分別進樣，得相應色譜圖(圖1)。結果對比對照品溶液色譜圖，供試品溶液色譜圖中10個有效成分在相應保留時間均有色譜峰，缺五味子陰性對照品色譜圖在五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素保留時間處有相應色譜峰，缺太子參陰性對照品色譜圖在太子參環(huán)肽B保留時間處無相應色譜峰，缺白花蛇舌草陰性對照品色譜圖在蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚、熊果酸保留時間處無相應色譜峰。供試品溶液色譜圖中各色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度>1.5，理論板數(shù)按五味子醇甲計>12 000，拖尾因子均小于1.05，說明該色譜系統(tǒng)專屬性較好。

注：A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺白花蛇舌草陰性對照溶液；D.缺太子參陰性對照溶液；E.缺五味子陰性對照溶液；1.蘆??；2.齊墩果酸；3.槲皮素；4.太子參環(huán)肽B；5.山柰酚；6.熊果酸；7.五味子醇甲；8.五味子酯甲；9.五味子甲素；10.五味子乙素。圖1 肝復康丸UPLC圖

2.3.2線性關系考察 分別精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液0.16、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL，分別置于2 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件分別進樣3 μL，記錄色譜圖。以各成分的質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，計算相應回歸方程和相關系數(shù)，見表1。結果表明，各成分均有良好的線性關系。

表1 肝復康丸10個有效成分的回歸方程及線性范圍

取2.2.1項下混合對照品溶液，用甲醇倍比稀釋，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，取各成分峰面積信噪比(S/N)為10時的混合對照品溶液質(zhì)量濃度為定量限(LOQ)，結果蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素LOQ分別為0.09、0.04、0.15、0.11、0.17、0.28、0.19、0.07、0.04、0.07 μg·mL-1。

2.3.3精密度試驗 取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，連續(xù)進樣6次。結果蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD分別為0.66%、0.57%、0.81%、0.32%、0.48%、0.39%、0.71%、0.69%、0.53%、0.40%，均符合儀器精密度要求。

2.3.4穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(批號：20180704)，分別于制備后0、4、8、16、20、24 h按2.1項下色譜條件進樣3 μL。結果蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為2.41%、1.85%、1.26%、2.25%、2.07%、1.63%、1.90%、1.14%、2.13%、1.57%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復性試驗 取供試品細粉(批號：20180704)6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣3 μL測定。結果樣品中蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素平均質(zhì)量分數(shù)分別為1.142、1.586、0.973、0.647、0.871、2.758、3.765、2.254、0.963、0.791 mg·g-1，RSD分別為0.51%、0.92%、0.47%、0.38%、1.74%、0.95%、0.69%、1.22%、0.43%、1.56%，表明該方法重復性良好。

2.3.6加樣回收率試驗 取已知含量供試品(批號：20180704)細粉9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于100 mL錐形瓶中，分成3組，分別精密加入含蘆丁(0.229 mg·g-1)、齊墩果酸(0.318 mg·g-1)、槲皮素(0.195 mg·g-1)、太子參環(huán)肽B(0.130 mg·g-1)、山柰酚(0.175 mg·g-1)、熊果酸(0.553 mg·g-1)、五味子醇甲(0.755 mg·g-1)、五味子酯甲(0.452 mg·g-1)、五味子甲素(0.193 mg·g-1)、五味子乙素(0.159 mg·g-1)的混合對照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2項下方法處理，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，記錄色譜圖，計算各成分的平均加樣回收率及其RSD，結果見表2。

表2 肝復康丸加樣回收率試驗結果

續(xù)表2

2.4 樣品含量測定

取13批肝復康丸供試品，分別按2.2.2項下條件制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，記錄色譜圖及峰面積，按外標法計算蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素含量，每份樣品重復測定3次，計算平均值，結果見表3。

表3 肝復康丸各成分含量測定結果(n=3) mg·g-1

2.5 聚類分析

利用SPSS 22.0軟件[8-10]，以13批肝復康丸中10個有效成分含量為數(shù)據(jù)樣本，采用組間均聯(lián)法，以Euclidean距離平方為測度，進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖2。根據(jù)聚類分析樹狀圖，13批樣品分成3大類：S1～S4為Ⅰ類，S5～S7為Ⅱ類，S8～S13為Ⅲ類。

圖2 13批肝復康丸聚類分析

2.6 主成分分析

以13批肝復康丸中的10個成分含量為指標建立數(shù)據(jù)集，輸入SPSS 22.0軟件[11-15]，運用因子分析中的主成分分析處理，以特征值>1為提取主成分標準，共提取到A1和A22個主成分，累積方差貢獻率達97.189%>85%，說明A1和A22個主成分可解釋肝復康丸10個有效成分含量的97.189%，具有代表性。其中A1特征值為8.669，方差貢獻率為86.693%，A2特征值為1.050，方差貢獻率為10.496%。2個主成分的相關系數(shù)矩陣及因子得分矩陣見表4～5。由表4可知，蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚和熊果酸之間均具有較大的正相關性，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素之間均具有較大的正相關性。由表5因子得分矩陣可知，蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均對主成分A1的信息貢獻較大。

表4 肝復康丸主成分分析10個成分相關系數(shù)矩陣

表5 肝復康丸主成分分析因子得分矩陣

以每個主成分的特征值占累加特征值的百分比作為權重系數(shù)進行線性組合，可得到綜合得分。綜合得分越高，說明以10個有效成分為指標的肝復康丸質(zhì)量越好。由表6可知，C廠家產(chǎn)品質(zhì)量較好。

表6 13批肝復康丸主成分得分、綜合得分及排序

F=0.892F1+0.108F2

(1)

F代表綜合得分，F(xiàn)1和F2分別代表2個主成得分，其中Fn=FACn×相應特征值的算術平方根(n代表主成分，F(xiàn)AC為主成分的因子得分系數(shù))。

3 討論

3.1 提取方法考察

本實驗考察了超聲、加熱回流2種不同提取方法，結果無明顯差異，故選擇易于操作的超聲提取法；考察乙醇、80%乙醇、60%乙醇和40%乙醇4種不同提取溶劑及30、45、60 min 3種不同提取時間，結果60%乙醇超聲45 min時10個成分提取率較高，雜質(zhì)影響較小，故以60%乙醇超聲45 min為最終提取條件。

3.2 流動相的考察

本實驗流動相考察了甲醇、乙腈作為有機相，0.05%甲酸、0.05%磷酸、0.1%磷酸作為水相，結果顯示，乙腈為有機相時，在203 nm波段區(qū)基線較平穩(wěn)，信號干擾??；以0.05%磷酸和0.1%磷酸作為水相時，各主要成分分離效果較好，但0.1%磷酸pH低于色譜柱的使用范圍，故以乙腈-0.05%磷酸作為肝復康丸中10個成分的流動相系統(tǒng)，基線平穩(wěn)，10個成分分離完全，保留時間適中，峰形較好，專屬性強。

3.3 檢驗波長考察

本實驗采用二極管陣列檢測器，從190～400 nm波長全掃描，結果蘆丁、槲皮素、山柰酚在350～360 nm波長段有最大吸收，齊墩果酸、熊果酸在210 nm處有最大吸收，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在210～245 nm波長段有最大吸收，太子參環(huán)肽B在203 nm處有最大吸收，為提高測定的專屬性、準確度和靈敏度，本實驗選擇360 nm(0～3 min，蘆??；9～10 min，槲皮素；11～12 min，山柰酚)、210 nm(3～9 min，齊墩果酸；12～23 min，熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)、203 nm(10～11 min，太子參環(huán)肽B)的波長切換法測定肝復康丸中10個成分的含量。

3.4 液相色譜儀的考察

本實驗分別考察HPLC和UPLC分析，結果UPLC相較HPLC不僅大大縮短了分析時間(由84 min縮短到23 min)，而且溶劑用量更少，降低了分析成本，各主要成分的分離效果更好，靈敏度和專屬性更強，且測定結果準確、可靠，可用于肝復康丸的質(zhì)量控制。

目前，關于肝復康丸中有效成分的含量測定文獻資料較少，本研究建立了UPLC同時測量肝復康丸中的蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素10個成分的含量，經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率等方法學驗證準確有效，可為肝復康丸藥品質(zhì)量評價提供參考。