鹽脅迫下水稻根系細(xì)菌群落多樣性研究

李曉東,高 攀,焦 飛,胡建勇*,時(shí)春明,張人銘

(1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，新疆 烏魯木齊 830000)

【研究意義】新疆地處我國(guó)干旱半干旱地區(qū)，水資源時(shí)空分布不均，氣候條件特殊，鹽堿水域資源十分豐富。目前，這些鹽堿水資源受制于技術(shù)而未得到有效開(kāi)發(fā)利用，造成資源浪費(fèi)。從國(guó)內(nèi)外的實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)看，鹽堿水域漁業(yè)是解決鹽堿水域資源開(kāi)發(fā)的主要手段，而漁業(yè)養(yǎng)殖尾水的資源化利用是現(xiàn)代漁業(yè)的主要研究方向[1]。在傳統(tǒng)“魚(yú)-菜”、“魚(yú)-稻”綜合種養(yǎng)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出適合鹽堿水漁業(yè)的“魚(yú)-植物”綜合種養(yǎng)模式對(duì)鹽堿水漁業(yè)的發(fā)展、漁業(yè)養(yǎng)殖尾水的處理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】相比傳統(tǒng)的淡水池塘養(yǎng)殖，鹽堿水體復(fù)雜的離子結(jié)構(gòu)與漁業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的各類(lèi)無(wú)機(jī)、有機(jī)代謝廢物的共同作用對(duì)于共生植物生理生化的影響更重要，并且這些影響大部分是不利且機(jī)理不明的，而植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)與植物生長(zhǎng)發(fā)育有密切關(guān)系，尤其是根系有益菌群能夠促進(jìn)植物對(duì)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，增強(qiáng)對(duì)生物及非生物脅迫的抵御能力[2]。植物根系微生物群落包括存在于根內(nèi)的內(nèi)共生菌和根表的微生物菌群，其微生物種類(lèi)包括細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類(lèi)和原生動(dòng)物，就豐度而言，細(xì)菌含量最高，原生動(dòng)物最低[3-4]。采用傳統(tǒng)的微生物分離鑒定方法研究植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性存在許多弊端。近年來(lái)，微生物宏基因組技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為研究微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性提供了有效手段。因此，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)尤其是逆境下植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響對(duì)于揭示植物的抗逆機(jī)理具有重要意義[5-6]。在鹽脅迫條件下，植物根系微生物通過(guò)參與滲透調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)吸收等具體生理功能為共生植物提供保護(hù)，其本身群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化也受鹽脅迫的影響[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】相比傳統(tǒng)的土壤-植物-微生物生態(tài)系統(tǒng)，“魚(yú)-植物”共生模式下的水-植物-微生物生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)研究較為薄弱，尤其在鹽堿漁業(yè)方面?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】鑒于此，本研究通過(guò)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鹽脅迫下的水稻根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為鹽堿水漁業(yè)發(fā)展“魚(yú)-植物”共生模式奠定相關(guān)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以水稻品種秋田小町為研究對(duì)象，經(jīng)育苗，大田生長(zhǎng)，2019年7月10日移栽至新疆水生野生動(dòng)物救護(hù)中心待用；選擇高度一致的水稻幼苗定植于花盆，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組定植9株。實(shí)驗(yàn)組使用國(guó)產(chǎn)“蜀盆”牌無(wú)土栽培營(yíng)養(yǎng)液水培15 d后按照鹽濃度0(樣品名稱(chēng)OS-S0)、1 ‰(樣品名稱(chēng)OS-S1)、2 ‰(樣品名稱(chēng)OS-S2)、3 ‰(樣品名稱(chēng)OS-S3)、4 ‰(樣品名稱(chēng)OS-S4)、5 ‰(樣品名稱(chēng)OS-S5)加入NaCl脅迫15 d。剪取一定長(zhǎng)度的水稻根系經(jīng)PBS(pH7.4)緩沖液漂洗后，置于20 mLPBS(pH7.4)緩沖液中，搖床震蕩30 min后經(jīng)4 ℃ 12 000 r/min離心5 min富集根系土壤備用。

1.2 方法

1.2.1 根系土壤DNA提取 使用OMEGA公司E.Z.N.ATMMag-Bi-nd Soil DNA 試劑盒提取根系微生物DNA后凝膠檢測(cè)備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序 根系微生物DNA使用 Life公司Qubit2.0 DNA試劑盒精確定量后使用上海生工的細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。引物序列。341F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(barcode) GACTACHVGGGTATCTAATCC。

上述PCR產(chǎn)物經(jīng)引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增后使用0.6倍磁珠(AgencourtAMPure XP)富集后經(jīng)Life公司Qubit2.0 DNA試劑盒精確定量后委托上海生工使用Illumina MiseqTM平臺(tái)測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系細(xì)菌群落多樣性測(cè)序數(shù)據(jù)處理

測(cè)序結(jié)果使用Cutadapt去除接頭引物序列后使用PEAR拼接測(cè)序結(jié)果；Prinseq對(duì)拼接序列進(jìn)行過(guò)濾后得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果；Usearch去除預(yù)處理后序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列，隨后對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正，并調(diào)用Uchime鑒定嵌合體。隨后，去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)代表性序列進(jìn)行Blastn比對(duì)，低于閾值(97 %)的比對(duì)結(jié)果認(rèn)為是靶區(qū)域外序列，并剔除掉該部分序列，最終得到可用于劃分操作分類(lèi)單元( Opera-tional taxonomic units，OTU)的序列數(shù)(表1)。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理結(jié)果

2.2 根系細(xì)菌群落多樣性

Usearch對(duì)前述有效序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類(lèi)，以序列之間的相似性不低于97 %的序列定義為一個(gè)OUT，最終得到的樣品OTU用韋恩圖表示(圖1)，不同鹽濃度脅迫處理下水稻根系微生物OTU絕大部分為共有類(lèi)型，特有類(lèi)型數(shù)量在不同樣品間差異較大；為更好表示出本研究不同處理間樣品OTU的相似性和差異關(guān)系，基于Beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類(lèi)分析后使用非加權(quán)組平均法UPGMA算法構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu)(圖2)，不同鹽濃度脅迫下相似濃度均聚于一個(gè)分支，說(shuō)明OUT相似性較高。

樣品的多樣性研究可通過(guò)多樣性分析(Alpha多樣性)反映微生物群落的豐度和多樣性，本研究使用Mothur計(jì)算不同處理樣品間多樣性指數(shù)(表2)。為更好地表示不同處理間樣品的菌群豐富度、測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理及不同樣品所含物種的豐富程度和均勻程度，分別構(gòu)建了稀釋曲線(圖3)和Rank-abundance曲線(圖4)，發(fā)現(xiàn)隨著擴(kuò)增數(shù)的增加稀釋曲線逐漸平緩說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，而Rank-abundance曲線較為粗糙，說(shuō)明不同處理水稻根系微生物群落組成均勻程度低，不同類(lèi)群差異較大。

表2 不同處理間樣品多樣性指數(shù)

對(duì)OUT進(jìn)行物種分類(lèi)信息分析是群落多樣性研究的常用手段，本研究采用RDP classifier分類(lèi)方法，在科 (family，圖5)、屬 (genus，圖6)水平上對(duì)各處理組細(xì)菌菌群含量均高于0.1 %的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行了分類(lèi)分析。

2.3 根系細(xì)菌不同群落相關(guān)性分析

通過(guò)分析科屬水平上各處理組細(xì)菌菌群含量均高于0.1 %的菌群與鹽度的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在科水平上，Rhodobacteraceae科、Phyllobacteriaceae科與鹽度有顯著的正相關(guān)性，而Planctomycetaceae科、Pseudomonadaceae科、Verrucomicrobiaceae科、Caldilineaceae科、Anaerolineaceae科、Rhodospirillales科與鹽度有顯著的負(fù)相關(guān)性，Comamonadaceae科、Chitinophagaceae科、Acidobacteria_Gp4科與鹽度的相關(guān)性不顯著；在屬水平上，Gemmobacter屬與Aquisphaera屬與鹽度有顯著的正相關(guān)性，而Pirellula屬、Rhizobacter屬、Luteolibacter屬、Rubinisp-haera屬、Caldimonas屬、Reyranella屬與鹽度有顯著的負(fù)相關(guān)性，Litorilinea屬與鹽度的相關(guān)性不顯著。

3 討 論

根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與生長(zhǎng)發(fā)育階段、生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)[7-9]，在不同鹽濃度處理下，水稻根系細(xì)菌群落OUT數(shù)隨著鹽濃度的增加呈現(xiàn)出先高后低的態(tài)勢(shì)，在鹽濃度為3 ‰時(shí)所獲得的OUT數(shù)最高，而韋恩圖也呈現(xiàn)出相同的結(jié)果；同樣，代表樣品菌群多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及代表樣品菌群豐度的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)均在鹽濃度為3 ‰時(shí)根系細(xì)菌群落豐度及多樣性最高。根據(jù)Rank-abundance曲線可知，不同處理間根系細(xì)菌群落均具有較大的豐度(橫軸長(zhǎng)度)且曲線不夠平滑，說(shuō)明細(xì)菌群落的均勻程度較低。在鹽堿條件下，植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與植物的種類(lèi)、品系、生長(zhǎng)發(fā)育階段有密切關(guān)系[10-12]，Yaish[12]研究發(fā)現(xiàn)，海棗在300 mmol/L NaCl溶液處理下，根系細(xì)菌處理組OUT數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)均比對(duì)照組低，表明鹽處理能夠降低植物根系細(xì)菌群落豐度及多樣性；但也有研究者認(rèn)為，低濃度鹽處理能夠增加土壤細(xì)菌群落數(shù)量[13]?；诒狙芯康慕Y(jié)果，筆者認(rèn)為鹽處理對(duì)植物根系細(xì)菌群落多樣性的影響與鹽濃度密切相關(guān)，高濃度處理(OS-S5)能夠顯著降低植物根系細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，該結(jié)論已在多種植物的相關(guān)研究中獲得證實(shí)[14]；而在3 ‰鹽濃度處理時(shí)根系細(xì)菌群落豐度及多樣性最高。在鹽耐受范圍內(nèi)，耐鹽植物能夠通過(guò)一些當(dāng)前不明的機(jī)理促進(jìn)有益菌群生長(zhǎng)，以維護(hù)其正常生理功能[15]，對(duì)于非鹽堿植物，筆者認(rèn)為出現(xiàn)該結(jié)果的原因在于對(duì)任何植物而言，如果鹽濃度在其可耐受范圍內(nèi)(OS-S1、OS-S2、OS-S3)，或許存在類(lèi)似于鹽堿植物的生理生化活動(dòng)，Yang[16]研究菊芋時(shí)獲得了與本研究相似的結(jié)果。

高通量測(cè)序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得不同處理間分類(lèi)學(xué)上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及結(jié)構(gòu)的差異是本研究的核心所在，對(duì)各處理組細(xì)菌菌群含量均高于0.1 %的優(yōu)勢(shì)菌群在科、屬水平上進(jìn)行分類(lèi)分析，在科水平上獲得11科；屬水平上獲得9屬。獲得的菌群科屬經(jīng)相關(guān)性分析共有8科、8屬與鹽濃度具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，其中Rhodobacteraceae科、Phyllobacteriaceae科、Gemmobacter屬、Aquisphaera屬與鹽濃度具有顯著正相關(guān)性(P<0.05)。Rhodobacteraceae科菌種絕大多數(shù)分離自海洋、鹽堿湖泊及鹽堿土中，少量分離自淡水環(huán)境中，其在海洋細(xì)菌群落中占30 %以上，并且常和真核生物共生[17]，現(xiàn)有研究表明Rhodobacteraceae科菌種可以通過(guò)促進(jìn)共生藻類(lèi)維生素合成以保證其在鹽堿環(huán)境下生存[18]，與鹽濃度顯著相關(guān)的Gemmobacter屬屬于該科[19]。Phyllobacteriaceae科菌種廣泛分布于各類(lèi)環(huán)境中，在黃豆和苜蓿中該科菌種能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)[20]；在鹽脅迫條件下，Phyllobacteriaceae科菌種可通過(guò)ACC脫氨酶基因的表達(dá)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[21]。相比前述科屬，Aquisphaera屬為本研究獲得的最具特殊的，就當(dāng)前而言，該屬僅有一種為Aquisphaeragiovannonii(https://lpsn.dsmz.de/)，其是否有利于提高植物的抗鹽堿能力目前未見(jiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)采用水培方式研究植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)，可為后續(xù)的鹽堿水漁業(yè)“魚(yú)-植物”綜合種養(yǎng)模式提供技術(shù)支持，因?yàn)楫?dāng)前我國(guó)“魚(yú)-植物”綜合種養(yǎng)模式廣泛采用生物浮床進(jìn)行生產(chǎn)，這樣的生產(chǎn)系統(tǒng)對(duì)植物而言其實(shí)就是改進(jìn)版的水培系統(tǒng)，總而言之，在不同鹽濃度脅迫下，水稻根系細(xì)菌群落豐度及多樣性隨著鹽濃度的增加呈現(xiàn)出先高后低的態(tài)勢(shì)，3 ‰鹽濃度脅迫下最高，5 ‰鹽濃度脅迫下最低；Rhodobacteraceae科、Phyllobacteriaceae科、Gemmobacter屬、Aquisphaera屬與鹽濃度具有顯著正相關(guān)性(P<0.05)。因此，這些科屬所屬菌種在今后鹽堿水漁業(yè)發(fā)展“魚(yú)-植物”綜合種養(yǎng)具有潛在利用價(jià)值。