荸薺淀粉合成酶AGPase的基因克隆及表達(dá)分析

董偉清，江 文，何芳練*，邱祖楊，蔣慧萍，黃詩(shī)宇，劉莉莉，何春紅，楊干德

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2. 荔浦市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣西 荔浦 546600)

【研究意義】荸薺[Eleocharisdulcis(N. L. Burman) Trinius ex Henschel]為莎草科多年生淺水草本植物，球莖質(zhì)脆多汁，主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為碳水化合物，淀粉是其主要儲(chǔ)藏形式，但在不同品種中差異較明顯[1-2]。植物淀粉生物合成受ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SSs)、淀粉分支酶(SBEs)和脫分支酶(DBEs)的關(guān)鍵基因調(diào)控[3]，其中AGPase是淀粉生物合成的起始酶和限速酶，其活性直接影響淀粉合成的速率[4]。但迄今關(guān)于荸薺AGPase的基因序列和結(jié)構(gòu)等分子生物學(xué)特性及其在球莖發(fā)育過程中的表達(dá)情況尚不明確。因此，克隆荸薺AGPase的基因并對(duì)其結(jié)構(gòu)和表達(dá)情況進(jìn)行分析，對(duì)研究荸薺淀粉生物合成機(jī)制及培育高淀粉荸薺品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高等植物的AGPase是一個(gè)異源四聚體(α2β2)，由2個(gè)大亞基和2個(gè)小亞基構(gòu)成，大亞基偏重于對(duì)酶活性的構(gòu)象進(jìn)行調(diào)節(jié)，小亞基行使AGPase的催化功能[5]。已有研究表明，編碼AGPase的基因表達(dá)與淀粉合成速率一致，在淀粉合成中發(fā)揮重要作用[6-8]。Beyene等[9]通過轉(zhuǎn)基因沉默木薯AGPase大亞基基因(MeAPL3)，發(fā)現(xiàn)木薯貯藏根的淀粉和干物質(zhì)含量顯著降低，葉柄/莖角增加，葉片下垂。宋波濤等[10]將sAGP基因?qū)腭R鈴薯，明確了該基因能提高馬鈴薯塊莖淀粉含量。Cheng等[11]通過蓮藕AGPase大亞基基因的多態(tài)性開發(fā)FMAGPL-I1功能標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)含有362 bp片段的40個(gè)荷花品種總淀粉含量較少，為提高蓮藕淀粉含量的分子標(biāo)記輔助選育效率提供了依據(jù)?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)荸薺淀粉生物合成的研究?jī)H見通過對(duì)葉片和球莖等組織的高通量測(cè)序獲得涉及淀粉生物合成相關(guān)基因的報(bào)道[12-14]，鮮見關(guān)于荸薺AGPase的基因克隆、基因序列及其結(jié)構(gòu)等分子生物學(xué)特性分析，以及EdAPS1基因在球莖發(fā)育過程中表達(dá)情況的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆荸薺編碼AGPase小亞基基因(EdAPS1)的cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EdAPS1基因在不同荸薺組織和球莖發(fā)育過程中的表達(dá)情況，為探究荸薺淀粉生物合成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試荸薺為地方品種桂林馬蹄，2019年7月下旬種植于廣西桂林市荔浦市修仁鎮(zhèn)念村示范基地。根據(jù)荸薺球莖發(fā)育時(shí)期，分別于移栽大田后90、100、110和120 d進(jìn)行地上部和地下部取樣，其中，地上部取葉狀莖，地下部取球莖、匍匐莖和根，洗干凈備用。每次取樣約2.0 g，共取樣4次，3次重復(fù)。每次取樣后立即用液氮速凍，最后將速凍樣品置于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 參照天根生化科技(北京)有限公司的植物多糖多酚總RNA提取試劑盒說明，分別從荸薺移栽后不同時(shí)期的球莖及移栽后120 d的各組織樣品中提取總RNA。根據(jù)天根生化科技(北京)有限公司TIANScript II cDNA第一鏈合成試劑盒說明，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.2.2EdAPS1基因克隆 以荸薺球莖cDNA為模板，根據(jù)荸薺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得EdAPS1基因的注釋信息，設(shè)計(jì)特異克隆引物EdAPS1-F(5′-ACTCTCATTCATTCTCTCTCTC-3′)和EdAPS1-R(5′-TATGGCACTGAACCGAGCAAAC-3′)。PCR反應(yīng)體系20.0 μl：5×Phusion HF Buffer 4.0 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.4 μl，正、反向引物(10 μmol/L)各1.0 μl，Phusion DNA Polymerase(2 U/μl)0.2 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O補(bǔ)至20.0 μl。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY-Blunt Cloning Kit將目的片段連接到pEASY-Blunt載體上，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含100 mg/L Amp的LB平板上。挑取單克隆，以M13正向和反向引物進(jìn)行PCR陽性檢測(cè)，將陽性克隆送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3EdAPS1基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI的開放閱讀框(ORF)查找器(ORFfinder)在線工具查找分析EdAPS1基因cDNA序列的ORF；氨基酸序列的同源性比較采用DNAMAN 9完成；采用ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)和SignalP工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)分析EdAPS1蛋白的理化性質(zhì)和信號(hào)肽；利用NCBI的CD-search在線工具進(jìn)行EdAPS1蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析；利用SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行EdAPS1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析；利用PredictPro(https://www.predictprotein.org/home)在線預(yù)測(cè)EdAPS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)EdAPS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；最后運(yùn)用MEGA 5.1的鄰近相接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 基因表達(dá)分析 根據(jù)獲得的荸薺EdAPS1基因的cDNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物EdAPS2-F(5′-GCAGGCGACCACTTATACAGGA-3′)和EdAPS2-R(5′-TGGGCTTCTCGGCAAACTCAA-3′)，以荸薺18S rRNA(GenBank登錄號(hào)：MG742686.1)為模板設(shè)計(jì)熒光定量PCR內(nèi)參引物CWC1-F(5′-TTGACGGAAGGGCACCACCA-3′)和CWC1-R(5′-TCGCTCCACCAACTAAGAACGG-3′)。熒光定量PCR參照南京諾唯贊生物科技有限公司的2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明操作。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。利用2-△△Ct方法計(jì)算荸薺EdAPS1基因在球莖不同發(fā)育期和不同組織中的相對(duì)表達(dá)量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 荸薺總RNA提取及EdAPS1基因的克隆結(jié)果

將提取的荸薺葉片和球莖總RNA進(jìn)行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰(圖1)，說明所提取的RNA完整性較好，可用于后續(xù)的RT-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

以荸薺球莖總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1716 bp的目的基因片段(圖2)，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和菌落PCR鑒定，得到陽性克隆。通過測(cè)序獲得編碼AGPase小亞基基因的cDNA序列，并將其命名為EdAPS1基因，在GenBank公布的登錄號(hào)為MT127798。

2.2 EdAPS1基因的生物信息學(xué)分析

通過NCBI網(wǎng)站的ORFfinder查找分析，EdAPS1基因的cDNA序列包含1個(gè)完整的ORF(1521 bp)，編碼506個(gè)氨基酸(圖3)，編碼荸薺AGPase的小亞基。預(yù)測(cè)EdAPS1蛋白分子量為55.67 kD，分子式為C2469H3896N672O746S23，總原子數(shù)為7806，等電點(diǎn)為5.98，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為58，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為53，不穩(wěn)定指數(shù)為43.56，表明該蛋白不穩(wěn)定；脂肪指數(shù)為88.32，GRAVY平均水平為-0.149，表明該蛋白為親水性蛋白。利用SignalP工具信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，EdAPS1蛋白無信號(hào)肽(圖4)。在NCBI中預(yù)測(cè)EdAPS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白氨基酸序列第87～506位與磷酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶(Glucose-1-phosphate adenylyltransferase)高度相似，說明該蛋白具有相似的功能，屬于PLN02241超家族(圖5)。根據(jù)SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，EdAPS1蛋白的氨基酸序列第77～352位為NTP_transferase結(jié)構(gòu)域，第447～489位為PbH1結(jié)構(gòu)域(圖6)，其中，NTP_transferase結(jié)構(gòu)域具有將核苷酸轉(zhuǎn)移到磷酸糖上的能力；PbH1結(jié)構(gòu)域?yàn)槠叫笑?螺旋重復(fù)序列，該序列有助于保持蛋白整體穩(wěn)定，具有該結(jié)構(gòu)域的蛋白通常是以多糖為底物的酶。對(duì)EdAPS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和溶劑可及性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖7)顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成比例為螺旋結(jié)構(gòu)(Helix)占16.21 %，鏈狀結(jié)構(gòu)(Strand)占19.17 %，無規(guī)則卷曲(Loop)占64.62 %；溶劑可及性分析結(jié)果顯示，暴露(Exposed)占32.61 %，埋藏(Buried)占61.26 %，中間型(Intermediate)占6.13 %。EdAPS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)由17個(gè)α-螺旋、34個(gè)β-折疊和52個(gè)β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成(圖8)。

2.3 EdAPS1蛋白的氨基酸序列同源性比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將EdAPS1蛋白的氨基酸序列提交至NCBI進(jìn)行BLASTp同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)EdAPS1蛋白與油莎草(Cyperusesculentusvar.sativus)AGPase小亞基蛋白的同源性最高，一致性為88.69 %。利用DNAMAN 9對(duì)11種植物AGPase小亞基蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果(圖9)發(fā)現(xiàn)不同植物的AGPase小亞基蛋白氨基酸序列具有較高的同源性。其中，荸薺EdAPS1蛋白與油莎草相應(yīng)蛋白(ALL29329.1)的親緣關(guān)系最近，一致性為86.91 %；與中華獼猴桃(AFO84075.1)、刺毛黧豆(RDX86632.1)、月季花(XP024181373.1)和鳳梨(XP020109479.1)等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，一致性為68.80 %～79.64 %。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖10)表明，不同物種AGPase小亞基蛋白主要聚為兩大分支，其中，刺毛黧豆(Mucunapruriens)和歐洲油菜(Brassicanapus)等9個(gè)物種聚為一類；荸薺與油莎草2個(gè)物種聚為一類。荸薺與油莎草均為莎草科植物，二者間進(jìn)化關(guān)系接近，可推測(cè)其AGPase小亞基蛋白的生理特性與生態(tài)特征在進(jìn)化過程中具有相似特性。

2.4 EdAPS1基因的表達(dá)水平分析

熒光定量PCR結(jié)果(圖11)顯示，EdAPS1基因在荸薺的根、葉狀莖、匍匐莖和球莖中均有表達(dá)，其中在球莖中表達(dá)量最高，其次為葉狀莖，二者差異顯著(P<0.05，下同)，且均顯著高于在根和匍匐莖中的表達(dá)量，而在根中的表達(dá)量最低，但與在匍匐莖的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05，下同)。從圖12可看出，在球莖發(fā)育過程中，EdAPS1基因在球莖發(fā)育后期(S4，移栽后120 d)的相對(duì)表達(dá)量最高，且顯著高于其他發(fā)育時(shí)期，在球莖發(fā)育前期和中期(S1～S3，移栽90～110 d)的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。而荸薺球莖發(fā)育后期為體積迅速增大和干物質(zhì)含量迅速增加期，因此，推測(cè)EdAPS1基因在后期高表達(dá)與淀粉的快速積累相關(guān)。

3 討 論

本研究從荸薺中克隆獲得編碼AGPase小亞基基因EdAPS1的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)1716 bp，包含1個(gè)1521 bp的ORF，編碼506個(gè)氨基酸；EdAPS1蛋白的分子量為55.67 kD，理論等電點(diǎn)為5.98，具有NTP_transferase和PbH1結(jié)構(gòu)域；二級(jí)結(jié)構(gòu)由螺旋結(jié)構(gòu)(16.21 %)、鏈狀結(jié)構(gòu)(19.17 %)和無規(guī)則卷曲(64.62 %)組成；三級(jí)結(jié)構(gòu)由17個(gè)α-螺旋、34個(gè)β-折疊和52個(gè)β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成；EdAPS1蛋白與其他植物APS蛋白具有較高的同源性，在進(jìn)化上與油莎草親緣關(guān)系最近；EdAPS1基因表達(dá)主要集中于球莖且在球莖發(fā)育后期表達(dá)量最高。

本研究發(fā)現(xiàn)，荸薺EdAPS1蛋白的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)與馬鈴薯sAGP蛋白和芋CeAPS1蛋白等較相似，均具有NTP_transferase和PbH1結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其與馬鈴薯sAGP蛋白和芋CeAPS1蛋白具有相似功能[4，16]，后續(xù)可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，荸薺EdAPS1蛋白與油莎草中相應(yīng)蛋白(ALL29329.1)的親緣關(guān)系最近，其中荸薺屬于莎草科荸薺屬(Eleocharis)植物，油莎草屬于莎草科莎草屬(Cyperus)植物，說明AGPase小亞基在同科植物的進(jìn)化過程中趨于保守，與王立等[4]研究認(rèn)為芋CeAPS1蛋白與紫萍和蓮等相應(yīng)蛋白的相似性在80.00 %以上，具有較高保守性的觀點(diǎn)一致。

Siedlecka等[17]將AGPase小亞基基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥后，能在擬南芥的葉片、莖、花和根等部位驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，表明AGPase小亞基基因具有廣泛的表達(dá)性。本研究熒光定量PCR分析結(jié)果與其相似，EdAPS1基因在荸薺球莖、葉狀莖、匍匐莖和根中均有表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)集中在球莖，且在球莖發(fā)育后期表達(dá)量顯著提高。根據(jù)已有研究結(jié)果[18-19]，荸薺球莖在發(fā)育后期體積迅速增大，干物質(zhì)含量迅速增加，薄壁細(xì)胞中的淀粉粒大量積累、互相擠壓，占據(jù)細(xì)胞內(nèi)較多的空間，甚至影響細(xì)胞核的形態(tài)，說明淀粉積累是影響球莖干物質(zhì)含量增加的主要因素，推測(cè)本研究中荸薺EdAPS1基因在荸薺球莖發(fā)育后期表達(dá)量顯著提高與淀粉積累呈正相關(guān)，可作為闡明荸薺淀粉生物合成機(jī)制及培育高淀粉荸薺品種的參考依據(jù)。后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)淀粉代謝通路上相關(guān)酶如淀粉合成酶、淀粉分支酶和脫分支酶的基因功能研究，以期能系統(tǒng)地闡明荸薺淀粉合成的分子機(jī)制，為高淀粉荸薺分子育種提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

從荸薺中克隆獲得編碼AGPase小亞基基因(EdAPS1)，該基因包含一個(gè)1521 bp ORF，編碼506個(gè)氨基酸；荸薺的EdAPS1基因具有在球莖表達(dá)量最高，尤其在球莖發(fā)育后期表達(dá)量更高，且顯著高于球莖其他發(fā)育時(shí)期的特點(diǎn)。