大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物脅迫表達分析

邱 爽，張 軍，何佳琦，周雨明，李銘楊，翟 瑩*

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.吉林中智九方咨詢有限公司，吉林 長春 130000)

【研究意義】植物在遭受不良環(huán)境條件后，可以誘導(dǎo)合成大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來增加植物細胞的滲透壓，提高植物抵抗脅迫的能力，從而維持植物自身的代謝和生長發(fā)育。其中棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharides, RFOs)就是這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的典型代表，它們是高等植物中含量僅次于蔗糖的一類可溶性糖。肌醇半乳糖苷合成酶(Galactinol synthase, GolS)是RFOs生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[1]。大豆作為一種重要的經(jīng)濟作物，其GolS基因的功能鑒定對于大豆RFOs代謝途徑及大豆抗逆機制的研究都具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前已有大量關(guān)于GolS基因受逆境脅迫誘導(dǎo)表達的報道，且超量或異源表達該基因可以不同程度的提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。擬南芥中含有7種GolS基因，其中AtGolS1和AtGolS2可以被干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達，AtGolS3可以被低溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達[2]。AtGolS1與AtGolS2過表達轉(zhuǎn)基因植株中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量均增加，對氧化脅迫的耐受能力增強[3]。將AtGolS2在水稻中異源表達還可以提高轉(zhuǎn)基因水稻在干旱脅迫下的產(chǎn)量[4]。小麥TaGolS3的表達受外源脫落酸、低溫和鹽脅迫的誘導(dǎo)，同時還能被ZnCl2和CuCl2所誘導(dǎo)，通過對活性氧的調(diào)控，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對鋅脅迫的耐受性[5]。GolS基因表達的調(diào)控機制較為復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)多種植物轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控其表達，例如HSF、DREB和WRKY等[6-8]。但到目前為止，有關(guān)大豆中肌醇半乳糖苷合成酶的研究非常少見。【本研究切入點】本研究克隆了一個大豆GolS基因GmGolS，并對其非生物脅迫下的表達量進行檢測。【擬解決的關(guān)鍵問題】此研究為GmGolS基因在大豆抗逆基因工程育種中的進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因的克隆

在NCBI(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)中獲得一個功能未被鑒定的大豆GolS基因mRNA序列(Genebank登錄號：NM001251098)。使用RNAiso Plus試劑(Takara)提取大豆葉片總RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Novoprotein)合成第一鏈cDNA。根據(jù)GmGolS基因開放閱讀框(ORF)序列設(shè)計引物，上游引物為5′-GGAATTCCATATGATGGCTCCTAATATCACCACTG-3′，下游引物為5′-GGAATTCTTAAGCAGCAGATGGGGC-3′(其中下劃線部分分別代表限制性內(nèi)切酶位點NdeI和EcoR I)，以第一鏈cDNA為模板擴增基因的全長ORF序列。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，此步驟進行30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物連接至克隆載體pMD18-T(Takara)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取陽性菌落擴繁并提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI 和EcoR I對質(zhì)粒進行雙酶切，陽性質(zhì)粒送上海生工公司測序鑒定。

1.2 生物信息學(xué)分析

蛋白的分子量和等電點使用在線軟件ExPASy(http://expasy.org/tools/pi_tool.html)進行預(yù)測；蛋白的亞細胞定位使用在線軟件PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行預(yù)測；在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)搜索植物GolS基因；蛋白系統(tǒng)進化樹使用MEGA5.0軟件進行構(gòu)建。

1.3 非生物脅迫處理

在25 ℃培養(yǎng)室內(nèi)，配制Hoagland營養(yǎng)液水培大豆幼苗，光照條件為16 h光照/8 h黑暗。待大豆幼苗的第一片三出復(fù)葉完全展開時，進行非生物脅迫處理：將大豆幼苗置于含15 % PEG8000的營養(yǎng)液中模擬干旱脅迫；將大豆幼苗置于含150 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液中進行高鹽脅迫；將大豆幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫。分別在處理的0(即未處理)、1 、2 、5 、10 和 24 h 剪取0.1 g 第一片三出復(fù)葉，迅速置于液氮中，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR

使用RNAiso Plus試劑(Takara)提取上述各樣本的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280值檢測提取的RNA質(zhì)量。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Novoprotein)合成第一鏈cDNA。根據(jù)GmGolS基因ORF序列設(shè)計實時熒光定量PCR引物。上游引物為5′-TCTAAGCCTTGGAGGTACACTGG-3′，下游引物為5′-GGCACGGACGAACTTGACTTC-3′。選擇大豆組成型表達基因β-Tubuin(GenBank登錄號：GMU12286)作為內(nèi)參基因(F：5′-GGAAGGCT TTCTTGCATTGGTA-3′，R：5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀上，對GmGolS基因在非生物脅迫下的表達量進行檢測。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：2×TB Green Premix ExTaqⅡ(Takara) 10 μl、cDNA 2 μl、上下游引物各0.8 μl，補水至20 μl。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40個循環(huán)。所有處理均做3次重復(fù)，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmGolS基因的克隆

如圖1所示，從大豆葉片cDNA中擴增獲得一條大約1000 bp的條帶，與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的GmGolS基因序列(987 bp)大小相符合。將其連接克隆載體pMD18-T(圖1)，經(jīng)測序驗證，擴增所得產(chǎn)物正是GmGolS基因。

2.2 GmGolS序列及進化分析

由圖2顯示，GmGolS基因ORF全長987 bp，編碼328個氨基酸，分子量38.03 kDa，等電點5.79。GmGolS蛋白含有一個保守的錳離子結(jié)合序列DXD，一個相對保守的絲氨酸磷酸化位點及一個C末端疏水性的五肽結(jié)構(gòu)APSAA，這些都是植物GolS的典型特征[10-11]。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，GmGolS蛋白定位于細胞的葉綠體和/或細胞質(zhì)中。

將GmGolS蛋白氨基酸序列與其他植物中的13個GolS蛋白氨基酸序列進行進化分析。由圖3顯示，GmGolS蛋白與沙冬青AmGolS蛋白的親緣關(guān)系最近，其次與玉米ZmGolS1蛋白也具有比較近的親緣關(guān)系，與擬南芥AtGolS蛋白和小麥TaGolS蛋白的親緣關(guān)系最遠。

2.3 GmGolS在非生物脅迫下的表達

大豆幼苗經(jīng)干旱、高鹽和低溫脅迫處理后，利用實時熒光定量PCR對GmGolS的表達動態(tài)進行檢測。結(jié)果顯示：干旱處理后，GmGolS被誘導(dǎo)表達且響應(yīng)最為明顯，在處理后2 h 達到最大值，是對照0 h的155倍(圖4-A)；高鹽和低溫處理后，GmGolS也被誘導(dǎo)表達，但表達量的升高均不超過對照的10倍(圖4-B和4-C)。由此推測GmGolS可能主要在大豆應(yīng)對干旱脅迫時發(fā)揮功能。

3 討 論

RFOs代謝途徑與植物生長發(fā)育及植物抗逆性之間關(guān)系密切。GolS是RFOs生物合成起始的關(guān)鍵限速酶，它通過催化UDP-半乳糖和肌醇反應(yīng)合成肌醇半乳糖苷，再以此為供體，在棉籽糖合成酶和水蘇糖合成酶的作用下將蔗糖合成棉籽糖和水蘇糖等寡糖[12]。這些可溶性糖不僅可以作為細胞中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還可以作為植物適應(yīng)環(huán)境的信號物質(zhì)[13]。

GolS屬于多基因家族，僅在擬南芥中就發(fā)現(xiàn)了10個編碼GolS的基因[14]，大豆中也含有多個GolS基因(后續(xù)會另文發(fā)表)。不同GolS基因在植物應(yīng)對脅迫時的功能不盡相同[2, 15]，即不同的GolS基因可以被不同的逆境條件所誘導(dǎo)，同一逆境又可以同時誘導(dǎo)多種GolS基因的表達，所以不同的GolS基因的抗逆性也存在交叉[16]。但不同物種間的GolS具有很高的相似性，它們都具有一個對于GolS酶活至關(guān)重要的錳離子結(jié)合序列DXD[17]，一個相對保守的絲氨酸磷酸化位點及一個C末端疏水性的五肽結(jié)構(gòu)APSAA。亞細胞定位的不同可能意味基因功能上會存在差異。GmGolS蛋白可能定位于葉綠體和/或細胞質(zhì)中，這與前人研究結(jié)果相符[18]。

基因表達量檢測結(jié)果顯示，GmGolS對干旱脅迫的應(yīng)答要明顯強于對高鹽和低溫脅迫的應(yīng)答，是一個典型的干旱誘導(dǎo)型基因，推測其可能在大豆抗旱生理中起到重要作用。前人也報道了大量GolS提高轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的研究。例如在水稻中超表達擬南芥AtGolS2使轉(zhuǎn)基因水稻耐旱能力顯著提高[4]；在煙草中超表達牛耳草BhGolS1同樣使轉(zhuǎn)基因植株耐旱能力顯著提高[19]。玉米ZmGolS2受干旱脅迫誘導(dǎo)且能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性，研究發(fā)現(xiàn)其啟動子上存在2個脫水響應(yīng)元件DRE，ZmDREB2A可以與其中一個DRE元件結(jié)合從而上調(diào)ZmGolS2的表達[20]。而本研究中的GmGolS基因上游是否也存在轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其具體的調(diào)控機制如何，還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究從大豆中擴增得到編碼GolS的基因GmGolS。其ORF全長987 bp，編碼328個氨基酸，分子量38.03 kDa。GmGolS蛋白與沙冬青AmGolS蛋白的親緣關(guān)系最近。干旱、高鹽和低溫脅迫均可誘導(dǎo)GmGolS的表達，且GmGolS對干旱脅迫的響應(yīng)最為明顯。