水稻基因OsATS的克隆及功能鑒定

李曉旭 王 蕊 張利霞 宋亞萌 田曉楠 葛榮朝

研究簡(jiǎn)報(bào)

水稻基因的克隆及功能鑒定

李曉旭**王 蕊**張利霞 宋亞萌 田曉楠 葛榮朝*

河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024

植物胚胎特異性蛋白ATS3和植物的滲透脅迫響應(yīng)有密切關(guān)系, 本文對(duì)水稻基因的抗逆相關(guān)功能進(jìn)行了初步研究。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 水稻在鹽脅迫后基因表達(dá)量顯著增加。構(gòu)建基因過表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)化擬南芥植株, 抗逆性檢測(cè)表明,基因的過表達(dá)可以顯著提高擬南芥在萌發(fā)階段和成株階段的耐鹽性。隨后將過表達(dá)載體p1300-35S:和RNA干涉載體pTCK303--RNAi轉(zhuǎn)入水稻, 抗逆性分析表明,過表達(dá)水稻株系在萌發(fā)階段和苗期的耐鹽性顯著提高, 而基因RNAi水稻株系耐鹽性則明顯下降。qRT-PCR和生理指標(biāo)檢測(cè)表明,基因的表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)、、基因的表達(dá), 調(diào)控了水稻細(xì)胞中的脯氨酸、LEA蛋白質(zhì)含量, 進(jìn)而影響了水稻植株整體的耐鹽性。本研究初步揭示了基因的抗逆功能, 后續(xù)可通過調(diào)整該基因的表達(dá)量, 改良水稻的抗逆性。

水稻;基因; 過表達(dá); RNAi干擾; 生理指標(biāo)

水稻是我國(guó)乃至全世界重要的糧食作物之一[1], 水稻生產(chǎn)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著巨大作用, 直接關(guān)系著國(guó)民生計(jì)[2]。水稻在谷類作物中對(duì)鹽分脅迫響應(yīng)最為敏感, 鹽脅迫是導(dǎo)致水稻減產(chǎn)的重要原因之一, 是制約其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)的一個(gè)重要環(huán)境因素[3]。目前土壤鹽漬化在全世界范圍嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[4]。我國(guó)人口不斷增加, 而可耕地面積不斷減少, 這促使人們對(duì)鹽堿地的開發(fā)與利用產(chǎn)生了極大關(guān)注[5-6]。因此, 在我國(guó)農(nóng)作物育種工作中選育耐鹽堿的優(yōu)良品種顯得尤為重要。其中探究耐鹽相關(guān)基因及其耐鹽內(nèi)在生理機(jī)制, 成為了耐鹽堿農(nóng)作物選育的重要研究方向之一[4]。

生物脅迫和非生物脅迫是影響農(nóng)作物生長(zhǎng)、造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要原因, 植物在自身的生活周期中往往面臨著各種脅迫。在脅迫環(huán)境下, 植物通過調(diào)整特定的抗逆相關(guān)基因表達(dá), 來提高自身對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力。近年來, 水稻中已經(jīng)鑒定了一系列抗逆相關(guān)基因, 這些基因的表達(dá)產(chǎn)物可以明顯影響植物對(duì)生物和非生物脅迫的耐受能力。高繼平等定位克隆到位于水稻第1染色體的耐鹽相關(guān)基因, 其編碼的Na+載體蛋白, 在Na+循環(huán)、離子長(zhǎng)距離運(yùn)輸中起重要作用。當(dāng)水稻處于高鹽環(huán)境中時(shí), SKC1蛋白能將過量的Na+集中轉(zhuǎn)運(yùn)至水稻根部, 從而提高水稻耐鹽性[7-8]。彭靜靜等[9]研究發(fā)現(xiàn)水稻基因的過表達(dá)不僅能夠促進(jìn)擬南芥種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng), 而且在鹽脅迫下通過提高擬南芥內(nèi)源抗氧化酶活性、降低膜脂過氧化程度, 增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)一定程度鹽脅迫的耐受性。Liao等[10]研究表明水稻基因的過表達(dá)能夠使水稻和表達(dá)量上調(diào), 提高水稻對(duì)高鹽脅迫的耐受性。另外研究發(fā)現(xiàn), 水稻、、等基因均可通過不同的機(jī)制影響水稻的抗逆特性[11-15],和等轉(zhuǎn)錄因子基因則通過調(diào)控多種抗逆相關(guān)基因的表達(dá)從而提高水稻的抗逆性[16-20]。

胚胎發(fā)育晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant proteins, LEA)是在植物種子成熟后大量積累的一類親水蛋白[21]。研究表明, LEA家族基因廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成和衰老等生物學(xué)過程。在高鹽、干旱等非生物脅迫下, LEA蛋白還能夠?qū)χ仓昶鸬疥P(guān)鍵的保護(hù)作用[22-24]。水稻基因()與辣椒抗逆基因序列有一定同源性, 具有胚胎特異性蛋白ATS3保守結(jié)構(gòu)域和脂氧合酶2基因家族保守域[25]。研究表明, 植物胚胎特異性蛋白ATS3也是在成熟種子大量表達(dá)的一種蛋白, 和植物的滲透脅迫響應(yīng)有密切關(guān)系[26]。本文擬通過對(duì)基因在水稻中進(jìn)行過量表達(dá)及RNA干涉, 從而對(duì)其抗逆功能和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為日本晴水稻(L.cv. Nipponbare)、Columbia型擬南芥, 真核表達(dá)載體采用pCAMBIA1300 (簡(jiǎn)稱p1300), 植物轉(zhuǎn)化采用GV3101、EHA105型根癌農(nóng)桿菌, 總RNA提取試劑TRNzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、酶、限制性內(nèi)切酶和T4連接酶等, 購(gòu)自Takara Bio生物技術(shù)有限公司, 常用試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鹽脅迫后基因的表達(dá)模式 將培養(yǎng)14 d的水稻幼苗在140 mmol L–1NaCl溶液中處理0、1、6和12 h后, 剪取葉片, 提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 利用P1: 5'-CTGTCAACGACGGTTTCCAAG-3'、P2: 5'- GCATCGTGACCTTGGTGTAC-3', 以基因作為內(nèi)參, 對(duì)不同處理的cDNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè), 重復(fù)檢測(cè)3次, 確定基因在鹽脅迫后的表達(dá)模式。

1.2.2 目的基因的克隆及載體構(gòu)建 提取日本晴水稻幼苗葉片總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 利用高保真DNA聚合酶Prime Star對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物采用RP: 5'-CCTCGCCATCTCCTCAGCCAT-3' (I, 下畫線為酶切位點(diǎn), 下同)和LP: 5'-CCGACGTCGCAAACCATCACTG-3' (I)。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到pMD18-T載體?；驕y(cè)序正確后, 酶切p1300和pMD18-T-質(zhì)粒, 回收、連接獲得過表達(dá)載體p1300-35S:, 轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105、GV3101備用。

以pMD18-T-質(zhì)粒為模板, 用引物RNAiRP: 5'-CAGTGGGTCAGGGTCTAC-3' (I、I)和RNAiLP: 5'-CCAGATCAG AATCAGAATCTGATCTG-3' (IH I), PCR擴(kuò)增后連接到pMD18-T, 獲得陽性克隆pMD18-T-- RNAi?；驕y(cè)序后酶切pTCK303和pMD18-T-- RNAi質(zhì)粒, 首先采用內(nèi)側(cè)酶I/I進(jìn)行雙酶切, 電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌, 獲得正連載體pTCK303--RNAi-sense。之后提取pTCK303-- RNAi-sense和pMD18-T--RNAi質(zhì)粒, 采用外側(cè)酶I/H I進(jìn)行雙酶切, 構(gòu)建RNAi載體pTCK303--RNAi, 轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105備用。

以pMD18-T-質(zhì)粒為模板, PCR擴(kuò)增構(gòu)建pMD18-T--GFP, 測(cè)序準(zhǔn)確后進(jìn)行酶切、回收、連接獲得亞細(xì)胞定位載體p2300--GFP4, 轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101備用。

1.2.3 OsATS蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位 培養(yǎng)含有p2300--GFP4質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101, 制備浸染液, 通過注射器將農(nóng)桿菌液注入到煙草葉片內(nèi), 做好標(biāo)記, 在40~48 h之間, 通過激光共聚焦顯微鏡觀察OsATS的亞細(xì)胞定位情況。

1.2.4基因過表達(dá)擬南芥的獲得和抗逆性分析 培養(yǎng)含有p1300-35S:的農(nóng)桿菌GV3101, 利用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。取基因過表達(dá)純合體擬南芥和野生型擬南芥種子4℃春化3 d后, 分別消毒、播種于含150 mmol L–1NaCl、200 mmol L–1NaCl的MS培養(yǎng)基上, 正常光照培養(yǎng)3~4 d, 統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥成株的耐鹽性, 將培養(yǎng)14 d剛剛抽薹的基因過表達(dá)和野生型擬南芥每隔4 d澆灌200 mmol L–1NaCl進(jìn)行脅迫處理, 連續(xù)處理15 d。

1.2.5 水稻愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化及抗逆性檢測(cè) 利用水稻種子誘導(dǎo)愈傷組織, 利用含有p1300-35S:、pTCK303--RNAi的EHA105農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化獲得基因過表達(dá)水稻和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻。用含50 mg L–1潮霉素的水浸泡轉(zhuǎn)基因水稻種子至萌發(fā)。9 d后選取生根發(fā)芽的抗性株系, 分別移栽入微孔板中, Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)7 d, 然后分別轉(zhuǎn)入含140 mmol L–1NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中處理4~10 d, 恢復(fù)培養(yǎng)5 d, 觀察表型變化。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因水稻的生理指標(biāo)檢測(cè) 分別用含有清水和140 mmol L–1NaCl溶液培養(yǎng)野生型和轉(zhuǎn)基因水稻5 d,測(cè)定其脯氨酸含量、MDA含量。同時(shí)選取鹽脅迫后、葉齡相似的野生型水稻與轉(zhuǎn)基因水稻的葉片, 剪成小塊, 稱取0.2 g, 將葉片壓入10 mL蒸餾水中, 真空抽氣1 h后重新充入空氣。將樣品置于室溫?cái)噭?dòng)浸提1 h后, 用電導(dǎo)儀測(cè)定樣品的處理電導(dǎo)率。再將同樣的葉片樣品放入100℃沸水浴15 min, 轉(zhuǎn)入清水中冷卻10 min, 測(cè)定其煮沸電導(dǎo)率。電導(dǎo)率公式為: 相對(duì)電導(dǎo)率(%) ＝ (處理電導(dǎo)率-空白電導(dǎo)率) / (煮沸電導(dǎo)率-空白電導(dǎo)率)×100。

1.2.7基因過量表達(dá)水稻中相關(guān)基因表達(dá)量的檢測(cè) 利用總RNA提取試劑盒提取水稻總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 以水稻基因(AK071586)為內(nèi)參, 對(duì)水稻脯氨酸脫氫酶基因(proline dehydrogenase, AK121010)、吡咯啉-5-羧酸合酶基因(δ-1-pyrroline-5-carboxylate synthase 1, AK101985)、晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白基因(late embryogenesis abundant protein, AK063984)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè), 每個(gè)樣本3次重復(fù), PCR在ABI 7300儀器上進(jìn)行?

差異顯著性分析采用-test 方法, *< 0.05、**< 0.01。

The significant difference is evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫后OsATS基因在水稻中的表達(dá)模式

對(duì)鹽脅迫處理的日本晴水稻幼苗進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明, 在水稻受到140 mmol L–1NaCl脅迫后,基因表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著增加, 1 h后即上升到脅迫處理前的3倍左右。此后, 在鹽脅迫處理6 h和12 h時(shí), 其表達(dá)量均維持在較高水平(圖1)。

2.2 OsATS蛋白的亞細(xì)胞定位

利用煙草葉片對(duì)OsATS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示, 對(duì)照試驗(yàn)中注射含有p2300-GFP質(zhì)粒菌株的煙草葉片在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均有綠色熒光, 而注射含有p2300--GFP質(zhì)粒菌株的煙草葉片只在細(xì)胞核有綠色熒光(圖2), 說明OsATS蛋白在細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞核。

2.3 OsATS基因的克隆與轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

以日本晴水稻cDNA為模板擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為624 bp的基因序列, 構(gòu)建過表達(dá)載體p1300-35S:。利用含有p1300-35S:質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥, 在含有潮霉素的MS培養(yǎng)基上逐代篩選獲得陽性純合體轉(zhuǎn)基因擬南芥。對(duì)獲得的35S:轉(zhuǎn)基因擬南芥提取葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè), 過表達(dá)植株OX-1、OX-4和OX-5轉(zhuǎn)基因擬南芥均擴(kuò)增獲得了624 bp的特異條帶, 確定外源基因成功插入到3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的基因組之中(圖3)。對(duì)3個(gè)過表達(dá)擬南芥株系cDNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中, 由于野生型擬南芥沒有, 因此只能對(duì)qRT-PCR檢測(cè)獲得的ΔCt進(jìn)行比較(ΔCt值為樣本Ct值根據(jù)內(nèi)參基因Ct值調(diào)整后的數(shù)值), 最終確認(rèn)過表達(dá)擬南芥株系OX-1、OX-4、OX-5中基因均獲得了高水平的表達(dá), OX-5株系中基因的表達(dá)量最高(圖4)。

2.4 OsATS轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆性分析

將過表達(dá)擬南芥的3個(gè)純合體株系種子消毒后接種到含有150 mmol L–1和200 mmol L–1NaCl的MS培養(yǎng)基, 對(duì)其種子萌發(fā)階段的耐鹽性檢測(cè)結(jié)果表明, 在2種濃度的鹽脅迫下, 過表達(dá)擬南芥萌發(fā)率都顯著高于野生型, 其中OX-5株系在萌發(fā)階段的耐鹽性提高更加明顯, 尤其是對(duì)200 mmol L–1NaCl的耐受性提高較另外2個(gè)株系更加明顯(圖5)。

將培養(yǎng)14 d的Columbia野生型擬南芥、過表達(dá)擬南芥成株進(jìn)行200 mmol L–1NaCl鹽脅迫處理, 結(jié)果表明, 高鹽溶液脅迫15 d后, 野生型擬南芥葉片明顯枯黃, 植株瘦弱矮小, 而3個(gè)過表達(dá)擬南芥株系葉片, 均呈墨綠色, 可以正常抽薹、開花結(jié)實(shí), 果莢數(shù)目明顯比野生型較多(圖6)。因此,基因的過表達(dá)明顯提高了擬南芥成株對(duì)鹽脅迫的耐受性。

差異顯著性分析采用-test方法, ***<0.001。

The significant difference is evaluated by the Student’s-test. ***< 0.001.

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01。

The significant difference is evaluated by the Student's-test. *< 0.05, **< 0.01.

2.5 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其抗逆性鑒定

利用含有pTCK303--RNAi或p1300-35S:載體的農(nóng)桿菌, 分別對(duì)水稻愈傷組織進(jìn)行浸染, 分化培養(yǎng)后獲得基因過表達(dá)水稻和RNAi水稻。通過對(duì)基因過表達(dá)株系、RNAi株系和野生型水稻幼苗進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)表明, 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻OX-3、OX-4和OX-9株系中基因的表達(dá)量顯著增高, 而RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系、和的基因表達(dá)量則顯著下降(圖7)。

WT: 野生型水稻; OX:過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻株系;: RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系; 差異顯著性分析采用-test方法, ***< 0.001。

WT: wild type rice; OX:overexpression transgenic rice lines;: RNAi transgenic rice lines; The significant difference is evaluated by the Student’s-test. ***< 0.001.

對(duì)過表達(dá)水稻的3個(gè)純合體株系OX-3、OX-4、OX-9和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系、、在種子萌發(fā)階段的耐鹽性進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果表明, 在140 mmol L–1NaCl脅迫下,過表達(dá)水稻萌發(fā)速度比野生型水稻要快,RNAi水稻種子的萌發(fā)則相對(duì)緩慢, 且第5天其萌發(fā)率平均僅達(dá)到87.9%, 而此時(shí)過表達(dá)水稻與野生型水稻種子均全部萌發(fā)(圖8)。

對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)一致的日本晴野生水稻植株、p1300- 35S:轉(zhuǎn)基因株系OX-3、OX-4、OX-9和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系、、用140 mmol L–1NaCl溶液進(jìn)行脅迫培養(yǎng),過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻脅迫6 d、恢復(fù)5 d后葉片均出現(xiàn)枯萎變黃的現(xiàn)象, 但過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯強(qiáng)于日本晴植株, OX-3、OX-4、OX-9株系的綠葉率分別為21.3%、17.3%、23.3%, 而野生型水稻綠葉率僅為6%, 說明基因的過量表達(dá)可以顯著提高水稻植株的耐鹽性(圖9)。RNAi轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻鹽脅迫處理4 d、恢復(fù)5 d后同樣均有葉片枯萎的現(xiàn)象, 但是RNAi轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)萎蔫更為嚴(yán)重,、、株系的綠葉率分別為4.0%、6.7%、3.3%, 相對(duì)于野生型水稻20%的綠葉率, 水稻基因表達(dá)被干涉后其耐鹽性顯著降低(圖9)。

2.6 OsATS轉(zhuǎn)基因水稻的生理檢測(cè)

將野生型水稻、過表達(dá)水稻和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻幼苗用140 mmol L–1NaCl處理5 d后, 分別對(duì)其葉片的脯氨酸含量、丙二醛含量和細(xì)胞質(zhì)膜透性進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果表明,過表達(dá)水稻的脯氨酸含量的增加量顯著高于野生型, RNAi株系的脯氨酸在鹽脅迫前后較野生型水稻的含量均明顯較低。丙二醛含量檢測(cè)結(jié)果表明,過表達(dá)水稻鹽脅迫后的丙二醛含量明顯低于野生型水稻, RNAi株系在鹽脅迫后丙二醛含量則明顯較高。鹽脅迫后,過表達(dá)水稻的細(xì)胞質(zhì)膜透性明顯低于野生型水稻, 而RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的細(xì)胞質(zhì)膜透性則顯著高于野生型水稻(圖10)。

2.7 OsATS基因表達(dá)對(duì)水稻抗逆相關(guān)基因表達(dá)的影響

對(duì)基因過表達(dá)水稻株系OX-3和RNAi水稻株系進(jìn)行140 mmol L–1NaCl處理前后的、、等抗逆相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,基因過表達(dá)水稻在鹽脅迫前后、基因的表達(dá)量顯著較高?；騌NAi水稻中的表達(dá)量在鹽脅迫前明顯較高, 在鹽脅迫后, RNAi水稻中的表達(dá)量更是極顯著高于對(duì)照水稻和基因過表達(dá)水稻(圖11)。

A: 脯氨酸含量; B: 丙二醛含量; C: 細(xì)胞質(zhì)膜透性。差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***<0.001。

A: proline content; B: MDA content; C: relative electrolyte leakage; The significant difference is evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

3 討論

OsATS蛋白具有高度同源的植物胚胎特異性蛋白ATS3保守結(jié)構(gòu)域, 可能與水稻抵御生物和非生物脅迫的功能密切相關(guān), 我們對(duì)基因通過煙草花葉病毒CAMV 35S啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)或通過RNAi進(jìn)行干涉表達(dá), 以期確定該基因?qū)λ灸望}性的影響。首先,基因在擬南芥中的過表達(dá)明顯提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫下的萌發(fā)率, 使過表達(dá)擬南芥表現(xiàn)出更好的耐鹽性。隨后, 通過對(duì)基因過表達(dá)水稻和RNAi水稻進(jìn)行抗逆性檢測(cè), 表明無論是在萌發(fā)階段還是在幼苗生長(zhǎng)階段,基因過表達(dá)水稻表現(xiàn)出更好的耐鹽性, 而RNAi水稻則表現(xiàn)出明顯的敏鹽特點(diǎn)。生理指標(biāo)的檢測(cè)表明, 在鹽脅迫前后基因過表達(dá)水稻細(xì)胞中都具有更高的脯氨酸含量,基因RNAi水稻細(xì)胞中的水稻脯氨酸含量則明顯較低。脯氨酸作為細(xì)胞中一種重要的氨基酸小分子, 對(duì)細(xì)胞眾多代謝過程有著至關(guān)重要的影響[27]。在植物遭受鹽、旱等非生物脅迫時(shí), 脯氨酸在細(xì)胞溶質(zhì)中能維持穩(wěn)定的滲透壓, 同時(shí)可以高效清除胞內(nèi)由于脅迫產(chǎn)生的大量活性氧, 維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[28]。另外2項(xiàng)的生理指標(biāo)檢測(cè)表明,基因過表達(dá)水稻在鹽脅迫后胞內(nèi)丙二醛含量明顯較低, 細(xì)胞質(zhì)膜透性也比野生型水稻要低, 表明過量表達(dá)的OsATS蛋白質(zhì)使得水稻植株細(xì)胞在鹽脅迫后受損明顯減輕。而基因RNAi水稻植株中丙二醛、細(xì)胞質(zhì)膜透性兩項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)于野生型水稻明顯要高,基因表達(dá)量的下降造成水稻細(xì)胞受到了更明顯的鹽脅迫損傷。

亞細(xì)胞定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OsATS蛋白明顯位于細(xì)胞核, 但分析發(fā)現(xiàn)其并不具備轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)特征序列, 因此推測(cè)OsATS有可能通過間接調(diào)控的方式影響到了其他抗逆相關(guān)基因的表達(dá)。通過對(duì)相關(guān)基因的定量PCR檢測(cè),基因表達(dá)量的變化明顯影響了3個(gè)水稻基因、、的表達(dá)。OsP5CS是一種位于水稻細(xì)胞溶質(zhì)之中、具有谷氨酸激酶(GK)和C-谷氨酰磷酸還原酶(GPR)活性的雙功能酶, 是脯氨酸合成途徑中重要的限速酶, P5CS表達(dá)量的增加可明顯提高胞內(nèi)脯氨酸的大量積累[29]?胚胎發(fā)育晚期富集蛋白LEA3則可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 維持細(xì)胞膨壓, 減輕水分脅迫對(duì)植物造成的損傷, 與植物的抗逆性密切相關(guān)[30]。脯氨酸脫氫酶PDH屬于脯氨酸代謝途徑的重要蛋白酶, PDH與細(xì)胞中活性氧ROS的形成密切相關(guān)。胞內(nèi)大量ROS的生成則對(duì)細(xì)胞造成損傷, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡[31]。定量PCR檢測(cè)表明基因過量表達(dá)會(huì)造成表達(dá)量上升, 這應(yīng)該是過表達(dá)水稻胞內(nèi)脯氨酸積累的主要原因之一。另外,基因過表達(dá)水稻還通過基因的表達(dá)增強(qiáng), 更有效的解除了鹽脅迫造成的活性氧增高損傷。相對(duì)而言,基因RNAi植株、基因表達(dá)的受抑, 減弱了滲透脅迫保護(hù)物質(zhì)脯氨酸、LEA蛋白質(zhì)的積累。同時(shí),基因RNAi水稻中基因的更強(qiáng)表達(dá)使得細(xì)胞產(chǎn)生了更多的活性氧物質(zhì), 從而降低了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性。

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

The significant difference is evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

當(dāng)然, 本研究只是初步揭示了基因?qū)λ灸望}性的影響及其部分的內(nèi)在機(jī)理, 至于該基因的表達(dá)對(duì)水稻在干旱等其他逆境脅迫下的抗逆性影響, 以及該基因涉及的具體信號(hào)傳導(dǎo)通路還有待進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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Cloning and functional identification of genein rice

LI Xiao-Xu**, WANG Rui**, ZHANG Li-Xia, SONG Ya-Meng, TIAN Xiao-Nan, and GE Rong-Chao*

College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China

The plant embryo specific protein ATS3 is closely related to osmotic stress response in plants. Here, the stress resistance related genewas preliminarily studied in rice. Fluorescence quantitative PCR showed that the relative expression level ofincreased significantly after salt stress in rice. The overexpression vector ofwas constructed and transformed into. The stress resistance test revealed that the overexpression ofgene could significantly improve the salt tolerance ofat germination and adult stages. After that, the overexpression vector p1300-35s:and RNA interference vector pTCK303-RNAi were transferred into rice. The stress tolerance analysis indicated that the salt tolerance ofoverexpression rice lines significantly increased at germination stage and seedling stage, while the salt tolerance ofRNAi rice lines significantly decreased. Results of qRT-PCR and physiological index detection demonstrated that the relative expression levels ofgene might regulate the protein content of proline and LEA cells by regulating the expression of,and, thus affecting the salt tolerance in rice. This study preliminarily revealed the stress resistance function ofgene, which laid a foundation for improving rice stress resistance by adjusting the relative expression level ofgene.

rice;genes; overexpression; RNA interference; physiological indexes

10.3724/SP.J.1006.2021.02079

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900104)和河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2016205158)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30900104) and the Natural Science Foundation of Hebei Province (C2016205158).

葛榮朝, E-mail: grcgp@sina.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

李曉旭, E-mail: jiandanxiaoxiao@163.com; 王蕊, E-mail: 1915435558@qq.com

2020-11-21;

2021-03-22;

2021-04-07.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210407.1627.006.html