結(jié)合QTL-seq和連鎖分析發(fā)掘水稻中胚軸伸長相關(guān)QTL

劉 暢 孟 云 劉金棟 王雅美,* Guoyou Ye,2

研究簡報

結(jié)合QTL-seq和連鎖分析發(fā)掘水稻中胚軸伸長相關(guān)QTL

劉 暢1孟 云1劉金棟1王雅美1,*Guoyou Ye1,2

1中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所, 廣東深圳 518120;2國際水稻研究所, 菲律賓馬尼拉 DAPO Box 7777

中胚軸長度(mesocotyl length, ML)是影響旱直播水稻出苗和早期幼苗活力的重要性狀。發(fā)掘中胚軸伸長相關(guān)位點, 解析其遺傳機制, 選育長中胚軸品種是促進旱直播技術(shù)推廣最為經(jīng)濟和有效的方式。本研究以長中胚軸品種‘Changai’和短中胚軸品種‘IR 145’為親本構(gòu)建的F2遺傳分離群體為材料, 構(gòu)建長池和短池并開展深度重測序(50×)。利用Δ(SNP-index)和G-value兩種方法在3號染色體29.56~33.28 Mb處鑒定到1個中胚軸伸長相關(guān)位點。在候選區(qū)域開發(fā)KASP標記, 對184個F2株系開展連鎖分析, 將候選區(qū)間縮小到28.89~31.03 Mb。結(jié)合基因注釋、連鎖分析和基因表達分析結(jié)果, 推測和為候選基因。這些基因分別與植物激素的調(diào)控和細胞分裂相關(guān)機制有關(guān)。本研究發(fā)掘了一個水稻中胚軸伸長相關(guān)位點, 對選育長中胚軸品種有一定幫助。

中胚軸; 混合分組分析法; Δ(SNP-index); 連鎖分析; 候選基因

水稻是我國主要的糧食作物之一, 傳統(tǒng)的水稻栽培方式以育秧移栽為主。近年來, 隨著勞動力成本的快速提高, 無需育秧移栽、節(jié)省大量人力和水資源的旱直播技術(shù)逐步成為我國水稻生產(chǎn)的發(fā)展方向[1-3]。然而, 旱直播水稻面臨的出苗率低、出苗不齊、生長勢差等問題長期無法解決。當前我國多數(shù)推廣水稻品種和骨干親本不適宜于旱直播[4]。在種子萌發(fā)過程中, 位于幼苗胚芽鞘節(jié)與胚根基部之間的中胚軸組織的伸長有助于水稻在土壤深處或水下播種時的成苗, 提高出苗的整齊度和生長勢, 是旱直播水稻應用的關(guān)鍵性狀[5-7]。因此, 發(fā)掘控制中胚軸伸長相關(guān)基因, 篩選和創(chuàng)制長中胚軸種質(zhì), 對培育適于旱直播的新品種, 促進旱直播技術(shù)的推廣具有重要意義。

水稻中胚軸長度(mesocotyl length, ML)是一種由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀[8]。數(shù)量遺傳性狀基因挖掘的傳統(tǒng)方法是利用雙親分離群體, 構(gòu)建高密度、均勻分布、覆蓋全基因組的分子標記連鎖圖, 結(jié)合表型數(shù)據(jù)來定位控制目標性狀的數(shù)量性狀基因位點(quantitive trait loci, QTL)。已有部分研究通過QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)的方法, 發(fā)掘了50余個水稻中胚軸伸長相關(guān)位點, 在12條染色體上均有分布[9-11]。近年來關(guān)于中胚軸伸長相關(guān)的遺傳機制已有報道。Xiong等[8]發(fā)現(xiàn)乙烯(ethylene, ETH)可通過抑制基因的表達、控制茉莉酸(jasmonic acid, JA)的生物合成來調(diào)控中胚軸的伸長。Zhao等[12]發(fā)現(xiàn)2個控制中胚軸伸長的基因,和, 在長中胚軸材料中的表達量顯著低于短中胚軸材料。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)基因可通過協(xié)調(diào)獨腳金內(nèi)酯(strigolactone, SL)和油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BR)的信號轉(zhuǎn)導來調(diào)節(jié)中胚軸的伸長。Zheng等[14]發(fā)現(xiàn)Karrikin信號通路與BR信號通路可共同調(diào)控中胚軸的伸長。

多數(shù)農(nóng)藝性狀為多基因控制的數(shù)量遺傳性狀[15-17], 其遺傳機制復雜, 發(fā)掘目標性狀控制位點, 并解析其遺傳機制, 選育優(yōu)良目標品種, 一直是困擾遺傳學家和育種家的難題。傳統(tǒng)的連鎖分析和GWAS方法均需要通過SSR、SNP芯片或重測序的方式針對遺傳群體所有材料開展基因型檢測, 耗費大量人力、物力和時間?；旌戏纸M分析法(bulked segregant analysis, BSA)是一種基于目標性狀差異,在研究群體中選擇一定量的個體(20~50個)并提取DNA, 等量混合構(gòu)建混池, 以進行基因型分析的方法[18]。DNA混池間存在多態(tài)性的標記, 則可看作與目標性狀基因關(guān)聯(lián)。BSA法不需要對每個單株進行基因分型, 可快速檢測出與目的基因緊密連鎖的標記, 能夠節(jié)約大量成本, 有效提升效率, 在水稻、玉米、小麥、油菜等多種農(nóng)作物數(shù)量性狀基因的定位研究中起著非常重要的作用[19-23]。結(jié)合BSA和二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)的QTL-seq技術(shù)結(jié)合了兩者的優(yōu)點, 可低成本、快速和高效地確定目標QTL。KASP技術(shù)是基于PCR的高通量SNP分型技術(shù), 可基于特定群體的變異信息, 在目標區(qū)域開發(fā)特異標記, 快速完成基因型檢測。KASP技術(shù)發(fā)展迅速, 在農(nóng)藝性狀QTL定位中發(fā)揮了重要的作用。將QTL-seq與基于KASP標記的連鎖分析相結(jié)合的策略, 在作物數(shù)量性狀基因挖掘研究中已得到應用[24-26]。Lu等[25]利用QTL-seq定位到一個控制黃瓜早花性狀的主效QTL (), 結(jié)合遺傳連鎖分析, 將其定位在一個890 kb的基因組區(qū)域, 并推測為候選基因。Das等[16]將QTL-seq與傳統(tǒng)QTL定位相結(jié)合, 把控制鷹嘴豆千粒重的QTL ()區(qū)域由1.37 Mb縮小到35 kb范圍內(nèi)。Wang等[24]在F2群體中利用QTL-seq將控制甘藍型油菜分枝角度的QTL定位在6號染色體17.74~18.32 Mb之間。

相較于傳統(tǒng)的連鎖分析和GWAS分析, QTL-seq可快速、高效地發(fā)掘控制作物重要農(nóng)藝性狀的遺傳位點, 在數(shù)量基因發(fā)掘領(lǐng)域已有較為成熟的應用[27-29]。盡管中胚軸相關(guān)遺傳研究已有部分報道, 但已發(fā)掘的遺傳位點仍不能滿足當前長中胚軸育種的需求。因此, 發(fā)掘新的中胚軸伸長相關(guān)QTL, 針對目標QTL開發(fā)可用分子標記對于深入探究水稻中胚軸伸長機制, 創(chuàng)制長中胚軸種質(zhì)十分必要。本研究采用前期篩選到的長中胚軸品種‘Changai’與短中胚軸品種‘IR 145’構(gòu)建的F2群體為材料, 利用QTL-seq和區(qū)間連鎖分析相結(jié)合的方法, 發(fā)掘控制中胚軸伸長的基因組區(qū)段及目標基因, 解析中胚軸伸長遺傳機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以短中胚軸材料‘IR 145’ (0.18 cm)為母本, 長中胚軸材料‘Changai’ (4.75 cm)為父本, 于2018年6月配制雜交組合, 收獲F1代種子后, 同年12月在海南試驗基地進行南繁加代, 2019年4月單株采收獲得F2代種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng)與中胚軸長度測定 挑選720粒飽滿無開裂的種子, 播種于裝有定量均質(zhì)營養(yǎng)土的10×5孔穴盤內(nèi), 每孔深度9.5 cm, 上層直徑4.5 cm, 底層直徑2.1 cm, 每穴孔內(nèi)播種15粒, 共計播種48穴, 其余兩穴種植親本, 確保籽粒間無互相擠壓并覆蓋營養(yǎng)土至與穴孔表面平齊。稱取500 g營養(yǎng)土至托盤內(nèi)并壓實, 將穴盤置于托盤內(nèi), 取適量純凈水分別噴灑穴盤與托盤, 并將其置于30℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每日定時澆水至出苗, 并記載發(fā)芽情況。恒溫培養(yǎng)7 d, 將穴盤從人工氣候箱中取出, 以流動水沖洗幼苗根部營養(yǎng)土。去除長勢較差單株, 選取均勻一致株系照相并利用ImageJ測量中胚軸長度。

1.2.2 混池測序 基于雙親本及F2分離群體的中胚軸長度構(gòu)建極長和極短混池。具體方式如下, 由F2群體中分別選取50株極長和極短株系, 采用CTAB法提取單株DNA, 并等量混合形成長池和短池。基于Illumina HiSeq 2500平臺(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司)對雙親本和極端池進行高深度(50×)全基因組重測序(PE150)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 將測序得到的raw reads進行質(zhì)控獲得clean reads。質(zhì)控原則如下: (1) 去除含接頭的reads; (2) 去除N比例大于10%的reads; (3) 去除低質(zhì)量reads (質(zhì)量值Q≤3的堿基數(shù)占整個read的50%以上)。利用BWA軟件將clean reads與日本晴參考基因組RGAP7 (Rice Genome Annotation Project, MSU)進行比對。采用GATK (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us)推薦算法發(fā)掘SNP (single nucleotide polymorphism)和InDel (insertion- deletion)位點。獲得SNP和InDel信息后, 以‘IR 145’作為參考等位基因, 采用滑動窗口策略來繪制2個子代混合池的SNP-index圖(以1 Mb為窗口, 10 kb為步長), 并過濾掉1 Mb范圍內(nèi)小于10個SNP位點的區(qū)域。為了減少測序和比對錯誤的影響, 同時過濾掉子代SNP-index都小于0.3和SNP深度小于6的位點。得到2個子代混合池的SNP-index圖后, 計算分離位點在子代2個極端池之間基因頻率的差值Δ(SNP-index), 并進行1000次置換檢驗, 選取99%置信水平作為閾值, 超過閾值外的區(qū)域為潛在的QTL候選區(qū)域。同時, 計算該群體的-value來驗證以上結(jié)果。Δ(SNP-index)和-value分析由基于R語言的QTL-seqr包進行[30]。

1.2.4 競爭性等位基因特異性PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)標記檢測 選取184個長勢正常的F2單株進行中胚軸長度測定。根據(jù)由QTL-seq研究中獲得的置信區(qū)間內(nèi)的SNP位點和側(cè)翼序列設計PCR擴增引物, 開發(fā)KASP分子標記。同時, 為規(guī)避遺傳背景影響, 其他每條染色體設計6個KASP標記作為背景標記。每個標記設計2條SNP特異性引物(F1/F2)和一條通用引物(R), F1尾部添加能夠與FAM熒光結(jié)合的特異性序列(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′), F2尾部添加能夠與HEX熒光結(jié)合的特異性序列(5′-GAAGGTCGGAGT CAACGGATT-3′)。引物序列見附表1 (未展示序列標記由長沙華智生物技術(shù)有限公司提供)。按照LGC (https:// www.lgcgroup.com/)提供的標準方法設計KASP引物, 由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用CTAB法提取對應單株葉片的DNA, 委托長沙華智生物技術(shù)有限公司對質(zhì)檢合格的DNA樣品進行KASP標記檢測。KASP擴增反應體系為10 μL, 具體為: 5 μL 2 × KASP Master Mix, 0.14 μL KASP Primer Mix, 1.0 μL模板DNA (60 ng μL–1), 3.86 μL ddH2O。KASP反應程序為: 94℃熱處理15 min; 94℃變性20 s, 61℃退火和延伸60 s, 10個循環(huán)(每循環(huán)降低0.6℃); 94℃變性20 s, 55℃退火和延伸60 s, 26個循環(huán); 4℃避光保存。

1.2.5 遺傳圖譜構(gòu)建及QTL鑒定 根據(jù)兩親本序列信息, 在利用QTL-seq發(fā)掘到的置信區(qū)間及其他背景染色體(每條染色體開發(fā)6個)設計KASP熒光標記, 在F2群體中選擇184個株系開展基因型檢測。與母本型相同的標記記為“2”, 與父本型相同的標記記為“0”, 雜合帶型的標記記為“1”, 模糊或缺失帶型的標記記為“?1”。選取分型準確且非偏分離的KASP標記, 采用JoinMap v4.0基于Kosambi函數(shù)計算遺傳距離[31], 構(gòu)建遺傳連鎖圖。利用ICI Mapping v4.2的復合區(qū)間作圖法(inclusive composite interval mapping, ICIM)[32]進行QTL分析, 將LOD值2.5作為判斷QTL存在的閾值。

1.2.6 表型數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2019對Changai/IR 145 F2群體的中胚軸長度進行基本統(tǒng)計量分析。

1.2.7 連鎖區(qū)域候選基因預測和表達量分析 水稻中胚軸伸長受到多種植物激素的調(diào)控, 如JA[8]、SL[13]、BR[13]、赤霉素(gibberellin, GA)[33]、生長素(auxin, IAA)[34-35]、ETH[8,33]、脫落酸(abscisic acid, ABA)[36]和細胞分裂素(cytokinin, CTK)[37]?；赒TL-seq分析和連鎖定位結(jié)果, 結(jié)合基因注釋信息, 初步確定候選基因清單(附表2)。于第8天取親本‘IR 145’和‘Changai’幼苗的中胚軸組織用于表達量檢測。采用TRIzol法提取總RNA并檢測總RNA濃度和純度, 根據(jù)純度數(shù)值選取優(yōu)質(zhì)RNA樣品并根據(jù)濃度值確定RNA模板加樣量。依照Thermo Scientific公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)合成20 μL cDNA。將cDNA模板用無菌雙蒸水稀釋5~10倍, 按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒要求配制qPCR反應體系, 在Step One Plus實時定量PCR儀器運行反應, 使用2-ΔΔCT運算方式進行基因表達水平數(shù)據(jù)分析。每個樣品設置3次重復, 以、和管家基因為內(nèi)參基因?qū)虮磉_數(shù)據(jù)歸一化分析, 計算候選基因在‘IR 145’和‘Changai’的相對表達量。

紅色標識處為對應品種中胚軸部位。左側(cè)為‘IR 145’, 中胚軸長度為0.18 cm左右。右側(cè)為‘Changai’,中胚軸長度為4.75 cm左右。

The mesocotyl section is marked by red mark. The left is ‘IR 145’ with a mesocotyl length of about 0.18 cm. The right is ‘Changai’ with a mesocotyl length of about 4.75 cm.

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F2分離群體的表型測定

在30℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d后, ‘IR 145’的中胚軸長度為0.18 cm, ‘Changai’的中胚軸長度為4.75 cm (圖1), 中胚軸長度呈極顯著差異(< 0.01)。在IR 145/Changai F2群體中, 中胚軸長度呈正態(tài)分布(圖2)。以上結(jié)果表明水稻中胚軸長度是一種典型的由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。

2.2 混池測序結(jié)果

2.2.1 測序質(zhì)量分析 對從F2群體中選擇的50個長中胚軸單株和50個短中胚軸單株分別構(gòu)建混池并開展高深度(50×)重測序。對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控后共計獲得數(shù)據(jù)107.9 Gb, 平均測序深度分別為51.32× (Changai), 47.49× (IR 145), 57.83× (長池)和66.53× (短池) (附表3)。將4個樣本的clean reads分別與日本晴參考基因組進行比對, 發(fā)現(xiàn)平均比對效率均在97.32%以上。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量合格, 可用于后續(xù)變異檢測與分析。

2.2.2 變異檢測及候選區(qū)間分析 將2個極端池的clean reads與‘IR 145’參考基因組進行比對后, 共計檢測到7,021,541個SNP。計算每個位點的SNP-index并過濾掉低質(zhì)量的SNP, 最終獲得3,267,590個高質(zhì)量SNP位點。根據(jù)SNP頻率, 對SNP-index在染色體上的分布進行作圖。以1 Mb為單位窗口, 10 kb為步長, 計算窗口內(nèi)的SNP-index平均值來反映子代的SNP-index分布并繪制分布圖。將長池與短池所有SNP位點的2個SNP-index相減得到?(SNP-index)值 (圖3)。以95%置信水平作為關(guān)聯(lián)染色體區(qū)域的篩選閾值, 在3號染色體鑒定出一個中胚軸伸長相關(guān)候選區(qū)域(29.56~33.28 Mb), 區(qū)間總長為3.72 Mb, 頂點位于31.29 Mb處(圖3-A)。-value分析也顯示該區(qū)間為顯著關(guān)聯(lián)區(qū)域(圖3-B)。

X軸表示F2群體中胚軸長度, 分為0.18~1.21, 1.21~2.23, 2.23~3.26, 3.26~4.29 和4.29~5.32 cm 5個水平。Y軸表示各個水平的個體數(shù)。

The X-axis represents the mesocotyl length of the F2population, which is divided into five levels: 0.18–1.21, 1.21–2.23, 2.23–3.26, 3.26–4.29, and 4.29–5.32 cm. The Y-axis denotes the number of individuals at each level.

A: Δ(SNP-index)在水稻12條染色體上的分布, 其中, 紅色和綠色代表的置信區(qū)間為95%和99%; B:-value在12條染色體上的分布, 閾值為FDR < 0.01.

A: the distribution of ?(SNP-index) is on 12 chromosomes in rice, and the confidence interval are 95% (red) and 99% (green), respectively; B: the distribution of-value is on 12 chromosomes with the interval of FDR < 0.01 in rice.

2.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL分析

基于親本及極端池之間的SNP信息開發(fā)KASP標記。經(jīng)過分型質(zhì)量和偏分離檢測后, 共計74個標記可用于后續(xù)群體基因型檢測, 其中包含12個置信區(qū)間內(nèi)標記和62個背景標記(附表1)。利用在親本間存在多態(tài)性的74個標記對184個F2代單株進行SNP檢測。利用ICI Mapping v4.2的ICIM法對中胚軸長度進行QTL定位。在3號染色體上檢測到一個中胚軸長度相關(guān)的QTL位點, 位于標記28,890,281~31,027,370之間, LOD值為2.65, 可解釋表型變異的8.82% (圖4)。

左側(cè)為3號染色體KASP標記遺傳圖譜, 右側(cè)為對應LOD曲線, LOD閾值設為2.5。

The genetic map constructed by KASP markers is on the left, whereas the corresponding LOD curve (LOD > 2.5) is on the right.

2.4 候選基因注釋及表達量分析

基于QTL-seq和連鎖分析結(jié)果, 結(jié)合日本晴基因組注釋信息, 初步篩選獲得14個候選基因(附表2)。采用qRT-PCR對上述基因進行表達模式驗證(圖5和附圖1)。結(jié)果表明,、和在長中胚軸品種‘Changai’和短中胚軸品種‘IR 145’中的表達量呈現(xiàn)顯著差異(< 0.05) (表1)。其中()和()在長中胚軸品種‘Changai’表達水平顯著高于短中胚軸品種‘IR 145’; 表明()和()參與并正調(diào)控中胚軸伸長。另外5個基因包括()、()、及2個同系物(、、), 在長中胚軸品種‘Changai’表達水平顯著低于短中胚軸品種‘IR 145’, 表明該5個基因參與并負調(diào)控中胚軸伸長。

3 討論

旱直播在多數(shù)水稻種植國家已得到大面積推廣, 是水稻生產(chǎn)的重要發(fā)展方向。解析水稻中胚軸伸長遺傳機制,對選育直播稻具有重要作用。當前, 水稻直播出苗相關(guān)因素的研究已有較多報道, 且已發(fā)掘部分中胚軸伸長相關(guān)位點, 為培育直播水稻品種提供了參考。但是, 當前已發(fā)掘位點依然無法滿足水稻直播育種的需求, 發(fā)掘新的位點及其連鎖標記, 對于解析中胚軸伸長遺傳機制, 選育直播水稻具有重要作用。本研究以‘IR 145’和‘Changai’2個中胚軸極端材料構(gòu)建F2群體, 結(jié)合QTL-seq和連鎖分析, 高效快速地發(fā)掘水稻中胚軸伸長相關(guān)基因, 為創(chuàng)制長中胚軸優(yōu)異種質(zhì)提供了材料。

本試驗利用‘Changai’與‘IR 145’構(gòu)建的F2分離群體進行QTL-seq分析, 在3號染色體上定位到了一個中胚軸發(fā)育相關(guān)的QTL(29.56~33.28 Mb)。對該位點進行標記開發(fā)并掃描F2分離群體, 將區(qū)間縮小至28.89~31.03 Mb。本研究表明結(jié)合QTL-seq與連鎖分析可快速解析數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)。隨著測序成本的迅速降低, 該策略的應用將會更加廣泛。中胚軸的伸長除受環(huán)境及植物激素的影響外, 還受自身遺傳因素的影響。目前, 已從多個遺傳群體中定位到了數(shù)十個與水稻中胚軸長度相關(guān)的QTL。其中, 3號染色體含有多個控制水稻中胚軸伸長的位點, 且在多個研究中均檢測到(附表4)。Redona和Mackill[38]利用Labelle和Black Gora的F2群體檢測到5個控制中胚軸長度的QTL, 分別位于1號、3號、5號和7號染色體上。Katsuta-Seki等[39]利用Daorenqiao和Surjumkhi的F2:3家系, 在3號、6號和11號染色體上定位了3個控制中胚軸長度的QTL。曹立勇等[9]利用秈稻IR64和粳稻Azucena雜交的F1代花粉離體培養(yǎng)獲得的DH群體, 定位了控制中胚軸長度的8個QTL, 分別位于1號、3號、6號、7號、8號和12號染色體上。Wu等[40]利用GWAS在1號、3號、4號、5號、6號和9號染色體上均定位到與中胚軸伸長相關(guān)的QTL, 其中, 3號染色體上來自Kasalath的等位位點貢獻率高達37.6%。Lee等[15]用Kasalath/Nipponbare構(gòu)建的97個回交重組自交系對中胚軸長度進行QTL定位, 檢測到、和三個位點, 其中在2個重復中均存在。Zhao等[12]利用GWAS在3號和7號染色體上發(fā)現(xiàn)2個控制中胚軸伸長的基因和, 并證明兩基因在長中胚軸材料中的表達量顯著低于短中胚軸材料, 其調(diào)控機理尚不明確。Liu等[10]利用207份東南亞和我國秈稻種質(zhì), 采用5種不同的基質(zhì)環(huán)境, 在染色體上(除10號、11號染色體外)發(fā)掘到16個遺傳位點, 分別解釋6.3%~ 15.9%的表型變異。本研究在3號染色體上檢測到的位點位于28.89~31.03 Mb處, 與Zhao等[12]和Lee等[15]發(fā)現(xiàn)的QTL位于同一區(qū)域。是一個在多項研究中均發(fā)現(xiàn)的中胚軸伸長相關(guān)穩(wěn)定QTL位點。

中胚軸伸長受到多種植物激素的調(diào)控。JA和SL抑制中胚軸伸長, BR低濃度和高濃度分別促進和抑制中胚軸伸長, GA、IAA、ETH、ABA和CK促進中胚軸伸長。其中, ETH是通過抑制JA的合成來促進中胚軸伸長, SL和CK拮抗調(diào)節(jié)中胚軸伸長, ETH、ABA和GA三者協(xié)同促進中胚軸伸長。目前, 報道克隆的基因均與激素調(diào)控相關(guān), 分別是、和(附表5)。研究發(fā)現(xiàn),作用于介導的乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑的下游以調(diào)節(jié)中胚軸的伸長, 通過促進JA合成相關(guān)基因的表達抑制中胚軸的伸長[8]。通過協(xié)調(diào)SL和BR信號傳導來調(diào)控中胚軸的伸長。其中, BR通過抑制對細胞周期蛋白CYC U2的磷酸化以促進中胚軸伸長。此外, BR還能通過增強相關(guān)基因的表達, 如促進細胞有絲分裂基因、縮短細胞周期基因等, 來增強細胞分裂。SL通過F-box蛋白D3降解被磷酸化的CYC U2來抑制中胚軸的伸長[13]。與TOPLESS-RELATED PROTEINs (TPRs)相互作用, 調(diào)節(jié)下游基因的表達以促進中胚軸的伸長[14]。GA則通過改變細胞微管的排列方向, 增強果膠甲酯化來促進細胞伸長, 進而促進中胚軸伸長[41]。IAA則主要上調(diào)細胞壁松弛酶活性, 使得細胞壁呈現(xiàn)持續(xù)松弛的狀態(tài), 通過細胞生長達到中胚軸伸長的效果[34-35,42]。ABA通過增強胚芽鞘節(jié)附近的細胞分裂, 抑制BR信號通路促進中胚軸伸長[43]。ETH通過抑制JA合成來促進中胚軸伸長[8]。

圖A~N依次表示14個候選基因在‘IR 145’與‘Changai’中胚軸組織中的相對表達量。內(nèi)參基因為GAPDH。、、、、、和在短中胚軸品種‘IR 145’和長中胚軸品種‘Changai’中的表達量呈現(xiàn)顯著差異(< 0.05)。

Figure A–N shows the relative expression levels of 14 candidate genes in the mesocotyl tissues of ‘IR 145’ and ‘Changai’, respectively. The internal reference gene is. The relative expression levels of,,,,,, andwere significantly different between the short-mesocotyl variety ‘IR 145’ and long-mesocotyl variety ‘Changai’ at< 0.05.

表1 水稻中胚軸伸長相關(guān)候選基因

綜合注釋信息、QTL-seq、連鎖分析和表達模式結(jié)果, 在定位區(qū)間內(nèi)鑒定到7個候選基因, 分別為、和。其中,和在長中胚軸品種‘Changai’表達水平顯著高于短中胚軸品種‘IR 145’, 表明和參與并正調(diào)控中胚軸伸長。隸屬的TIFY家族是特異性參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育和逆境反應多種生物進程, 該家族基因存在結(jié)合DNA的C2C2-GATA鋅指結(jié)構(gòu), 又稱GATA家族[44]。水稻GATA家族由20個基因構(gòu)成, 蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)/存在CCT結(jié)構(gòu)域, 可被轉(zhuǎn)錄后差異剪接從而行使不同功能[45]。在水稻幼苗期表達量最高, 并參與光依賴基因調(diào)控和硝酸鹽同化[46], 特定CCT結(jié)構(gòu)域表明其具有潛在的調(diào)節(jié)抽穗時間的能力[47]。類纖維合成酶在雄蕊和胚根中特異性表達, 催化非纖維素基質(zhì)多糖的合成, 促進原生及次生細胞壁的伸展[48]。細胞壁在細胞伸長擴張和形態(tài)形成中具有關(guān)鍵性作用, 松弛的細胞壁有利于中胚軸伸長, 有研究表明, 玉米中胚軸中特異性表達的類纖維合成酶通過增強細胞壁的伸展性調(diào)節(jié)中胚軸伸長[49-50]。

另外5個基因, 包括、、及2個同系物在長中胚軸品種‘Changai’表達水平顯著低于短中胚軸品種‘IR 145’, 表明該5個基因參與并負調(diào)控中胚軸伸長。ERF亞家族B族的轉(zhuǎn)錄因子在脅迫環(huán)境下調(diào)控植物生長,過表達致使植物的發(fā)芽率下降、抑制和應激基因表達, 是植物生長的負調(diào)節(jié)因子[51]。在生長缺陷型過表達植株富集表達, 并受γ射線(gamma ray, GR)和離子束(ion beam, IB)強烈誘導[52-53]。吲哚作為種間和種內(nèi)信號因子與水稻生長發(fā)育和防御系統(tǒng)的形成過程密切相關(guān), 水稻有5個基因編碼磷酸吲哚-3-甘油酶IGL, 其中(Os03g58300)是吲哚生物合成的真正的IGL。綜上所述,鑒定出7個控制中胚軸伸長候選基因, 均是第一次被發(fā)現(xiàn)參與中胚軸發(fā)育且存在不同方式的調(diào)控機制。下一步將針對這7個基因開展遺傳轉(zhuǎn)化以確認其功能。

請見網(wǎng)絡版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.chinacrops. org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c. wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

[1] Zhao G, Fu J, Wang G, Ma P, Wu L, Wang J. Gibberellin-induced mesocotyl elongation in deep-sowing tolerant maize inbred line 3681-3684., 2010, 129: 87–91.

[2] Liu H, Hussain S, Zheng M, Peng S, Huang J, Cui K, Nie L. Dry direct-seeded rice as an alternative to transplanted-flooded rice in central China., 2015, 35: 285–294.

[3] Chen Z, Tang Y T, Zhou C, Xie S T, Xiao S, Baker A J M, Qiu R L. Mechanisms of Fe biofortification and mitigation of Cd accumulation in rice (L.) grown hydroponically with Fe chelate fertilization., 2017, 175: 275–285.

[4] Matloob A, Khaliq A, Chauhan B S. Weeds of direct-seeded rice in Asia: problems and opportunities., 2015, 130: 291–336.

[5] Turner F T, Chen C C, Bollich C N. Coleoptile and mesocotyl lengths in semidwarf rice seedlings., 1982, 22: 43–46.

[6] Chung N J. Elongation habit of mesocotyls and coleoptiles in weedy rice with high emergence ability in direct-seeding on dry paddy fields., 2010, 61: 911–917.

[7] Zhang H, Ma P, Zhao Z, Zhao G, Tian B, Wang J, Wang G. Mapping QTL controlling maize deep-seeding tolerance-related traits and confirmation of a major QTL for mesocotyl length., 2012, 124: 223–232.

[8] Xiong Q, Ma B, Lu X, Huang Y H, He S J, Yang C, Yin C C, Zhao H, Zhou Y, Zhang W K, Wang W S, Li Z K, Chen S Y, Zhang J S. Ethylene-inhibited jasmonic acid biosynthesis promotes mesocotyl/coleoptile elongation of etiolated rice seedlings., 2017, 29: 1053–1072.

[9] 曹立勇, 朱軍, 顏啟傳, 何立斌, 魏興華, 程式華. 水稻秈粳交DH群體幼苗中胚軸長度的QTLs定位和上位性分析. 中國水稻科學, 2002, 16(3): 24–27.

Cao L Y, Zhu J, Yan Q C, He L B, Wei X H, Cheng S H. Mapping QTLs with Epistasis for mesocotyl length in a DH population fromcross of rice ()., 2002, 16(3): 24–27 (in Chinese with English abstract).

[10] Liu H, Zhan J, Li J, Lu X, Liu J, Wang Y, Zhao Q, Ye G. Genome-wide association study (GWAS) for mesocotyl elongation in rice (L.) under multiple culture conditions., 2019, 11: 49–64.

[11] Zhan J, Lu X, Liu H, Zhao Q, Ye G. Mesocotyl elongation, an essential trait for dry-seeded rice (L.): a review of physiological and genetic basis., 2020, 251: 1–14.

[12] Zhao Y, Zhao W, Jiang C, Wang X, Xiong H, Todorovska E G, Yin Z, Chen Y, Wang X, Xie J, Pan Y, Rashid M A R, Zhang H, Li J, Li Z. Genetic architecture and candidate genes for deep-sowing tolerance in rice revealed by non-syn GWAS., 2018, 9: 332–345.

[13] Sun S, Wang T, Wang L, Li X, Jia Y, Liu C, Huang X, Xie W, Wang X. Natural selection of a GSK3 determines rice mesocotyl domestication by coordinating strigolactone and brassinosteroid signaling., 2018, 9: 2523–2535.

[14] Zheng J, Hong K, Zeng L, Wang L, Kang S, Qu M, Dai J, Zou L, Zhu L, Tang Z, Meng X, Wang B, Hu J, Zeng D, Zhao Y, Cui P, Wang Q, Qian Q, Wang Y, Li J, Xiong G. Karrikin signaling acts parallel to and additively with Strigolactone signaling to regulate rice mesocotyl elongation in darkness., 2020, 32: 2780–2805.

[15] Lee H S, Sasaki K, Kang J, Sato T, Song W, Ahn S. Mesocotyl elongation is essential for seedling emergence under deep- seeding condition in rice., 2017, 10: 32–42.

[16] Das S, Upadhyaya H D, Baiai D, Kujur A, Badoni S, Narnoliya L, Kumar V, Tripathi S, Gowda C L, Sharma S, Sube S, Tyagi A K, Parida S. Deploying QTL-seq for rapid delineation of a potential candidate gene underlying major trait-associated QTL in chickpea., 2015, 22: 193–203.

[17] Lee H S, Sasaki K, Higashitani A, Ahn S N, Sato T. Mapping and characterization of quantitative trait loci for mesocotyl elongation in rice (L.)., 2012, 5: 13–22.

[18] Zou C, Wang P, Xu Y. Bulked sample analysis in genetics, genomics and crop improvement., 2016, 14: 1941–1955.

[19] Sun J, Yang L, Wang J, Liu H, Zheng H, Xie D, Zhang M, Feng M, Jia Y, Zhao H, Zou D. Identification of a cold-tolerant locus in rice (L.) using bulked segregant analysis with a next-generation sequencing strategy., 2018, 11: 1–12.

[20] Farooqi M Q U, Ma S, Lee J K. Bulk segregant analysis for the improvement of drought resistance in maize (L.) inbred lines as revealed by SSR molecular markers., 2018, 13: 34–51.

[21] Xu X, Li Q, Ma Z, Fan J, Zhou Y. Molecular mapping of powdery mildew resistance genein Chinese wheat landrace Shangeda using RNA-seq with bulk segregant analysis., 2018, 38: 23–34.

[22] Li C, Ling F, Su G, Sun W, Liu H, Su Y, Xin Q. Location and mapping of the NCLB resistance genes in maize by bulked segregant analysis (BSA) using whole genome re-sequencing., 2020, 40: 1–12.

[23] Miao L, Chao H, Chen L, Wang H, Zhao W, Li B, Zhang L, Li H, Wang B, Li M. Stable and novel QTL identification and new insights into the genetic networks affecting seed fiber traits in., 2019, 132: 1761–1775.

[24] Wang H, Cheng H, Wang W, Liu J, Hao M, Mei D, Zhou R, Fu L, Hu Q. Identification ofas a candidate gene for branch angle inby QTL-seq., 2016, 6: 38493–38502.

[25] Lu H, Lin T, Klein J, Wang S, Qi J, Zhou Q, Sun J, Zhang Z, Weng Y, Huang S. QTL-seq identifies an early flowering QTL located nearin cucumber., 2014, 127: 1491–1499.

[26] Lei L, Zheng H, Bi Y, Yang L, Liu H, Wang J, Sun J, Zhao H, Li X, Li J, Lai Y, Zou D. Identification of a major QTL and candidate gene analysis of salt tolerance at the bud burst stage in rice (L.) using QTL-Seq and RNA-Seq., 2020, 13: 55–68.

[27] Ehrenreich I M, Torabi N, Jia Y, Kent J, Martis S, Shapiro J A, Gresham D, Caudy A A, Kruglyak L. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants., 2020, 464: 1039–1042.

[28] Abe A, Shunichi K, Kentaro Y, Satoshi N, Hiroki T, Hiroyuki K, Hideo M, Kakoto Y, Chikako M, Muluneh T, Hideki I, Liliana C, Sophien K, Ryohei T. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap., 2012, 30: 174–178.

[29] Takagi H, Abe A, Yoshida K, Kosugi S, Natsume S, Mitsuoka C, Uemura A, Utsushi H, Tamiru M, Takuno S, Innan H, Cano L M, Kamoun S, Terauchi R. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations., 2013, 74: 174–183.

[30] Mansfeld B N, Grumet R. QTLseqr: an R package for bulk segregant analysis with next-generation sequencing., 2018, 11: 1–5.

[31] Kosambi D D. The estimation of map distance from recombination values., 1943, 12: 172–175.

[32] Meng L, Li H, Zhang L, Wang J. QTL IciMapping: integrated software for genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping in biparental populations., 2015, 3: 269–283.

[33] Watanabe H, Hase S, Saigusa M. Effects of the combined application of ethephon and gibberellin on growth of rice (L.) seedlings., 2007, 10: 468–472.

[34] Gray W M, Ostin A, Sandberg G, Romano C P, Estelle M. High temperature promotes auxin-mediated hypocotyl elongation in., 1998, 95: 7197–7202.

[35] Romano C P, Robson P R H, Smith H, Estelle M, Klee H. Transgene-mediated auxin overproduction in: hypocotyl elongation phenotype and interactions with thehypocotyl elongation andauxin-resistant mutants., 1995, 27: 1071–1083.

[36] Watanabe H, Takahashi K, Saigusa M. Morphological and anatomical effects of abscisic acid (ABA) and fluridone (FLU) on the growth of rice mesocotyls., 2001, 34: 273–275.

[37] Hu Z, Yamauchi T, Yang J, Jikumaru Y, Tsuchida-Mayama T, Ichikawa H, Takamure I, Nagamura Y, Tsutsumi N, Yamaguchi S, Kyozuka J, Nakazono M. Strigolactone and cytokinin act antagonistically in regulating rice mesocotyl elongation in darkness., 2014, 55: 30–41.

[38] Redona E D, Mackill D J. Mapping quantitative trait loci for seeding vigor in rice using RFLPs., 1996, 92: 395–402.

[39] Katsuta-Seki M, Ebana K, Okuno K. QTL analysis for mesocotyl elongation in rice., 1996, 13: 126.

[40] Wu J, Feng F, Lian X, Teng X, Wei H, Yu H, Xie W, Yan M, Fan P, Li Y, Ma X, Liu H, Yu S, Wang G, Zhou F, Luo L, Mei H. Genome-wide association study (GWAS) of mesocotyl elongation based on re-sequencing approach in rice., 2015, 15: 218–227.

[41] Zhao G, Wang J. Effect of gibberellin and uniconazole on mesocotyl elongation of dark-grown maize under different seeding depths., 2008, 11: 423–429.

[42] Masuda Y. Auxin-induced cell elongation and cell wall changes., 1990, 103: 345–370.

[43] Watanabe H, Takahashi K, Saigusa M. Morphological and anatomical effects of abscisic acid (ABA) and fluridone (FLU) on the growth of rice mesocotyls., 2001, 34: 273–275.

[44] Zhang C, Huang Y, Xiao Z, Yang H, Hao Q, Yuan S, Chen H, Chen L, Chen S, Zhou X, Huang W. A GATA transcription factor from soybean () regulates chlorophyll biosynthesis and suppresses growth in the transgenic., 2020, 9: 1036–1041.

[45] Ye H, Du H, Tang N, Li X, Xiong L. Identification and expression profiling analysis offamily genes involved in stress and phytohormone responses in rice., 2009, 71: 291–305.

[46] Nutan K K, Singla-Pareek S L, Pareek A. TheQTL-localized transcription factor OsGATA8 plays an important role in stress tolerance and seed development inand rice., 2019, 71: 684–698.

[47] Zhang L, Li Q, Dong H, He Q, Liang L, Tan C, Han Z, Yao W, Li G, Zhao H, Xie W, Xing Y. Three CCT domain-containing genes were identified to regulate heading date by candidate gene-based association mapping and transformation in rice., 2015, 5: 7663–7673.

[48] Liu D, Zehfroosh N, Hancock B L, Hines K, Fang W, Kilfoil M, Learned-Miller E, Sanguinet K A, Goldner L S, Baskin T I. Imaging cellulose synthase motility during primary cell wall synthesis in the grass., 2017, 7: 15111–15122.

[49] Inouhe M, Inada G, Thomas B R, Nevins D J. Cell wall autolytic activities and distribution of cell wall glucanases inL. seedlings., 2000, 27: 151–156.

[50] Erp H V, Walton J D. Regulation of thegene family by light in the maize mesocotyl., 2009, 229: 885–897.

[51] Zhuang J, Jiang H H, Wang F, Peng R H, Yao Q H, Xiong A S. A rice OsAP23, functioning as an AP2/ERF transcription factor, reduces salt tolerance in transgenic., 2013, 31: 1336–1345.

[52] Hwang S G, Kim D S, Hwang J E, Han A R, Jang C S. Identification of rice genes associated with cosmic-ray response via co-expression gene network analysis., 2014, 541: 82–91.

[53] Li X, Yang D L, Sun L, Li Q, Mao B, He Z. The systemic acquired resistance regulatorattenuates growth by repressing auxin signaling through promoting IAA-amido synthase expression., 2016, 172: 546–558.

Combining QTL-seq and linkage analysis to identify the QTL of mesocotyl elongation in rice (L.)

LIU Chang1, MENG Yun1, LIU Jin-Dong1, WANG Ya-Mei1,*, and Guoyou Ye1,2

1Agricultural Genomics Institute in Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, Guangdong, China;2International Rice Research Institute, Metro Manila DAPO Box 7777, Philippines

Mesocotyl length is an important trait, which affects seedling establishment and early seedling vigor after dry direct seeding. Identifying the loci related to mesocotyl elongation, analyzing the genetic mechanism and selecting varieties with long mesocotyl is the most economic and effective way to promote the popularization of dry direct seeding technology. In this study, an F2population constructed with ‘Changai’ (an extremely long mesocotyl variety) and ‘IR 145’ (an extremely short mesocotyl variety) was used to construct long and short DNA pool, which were re-sequenced at 50×level. Two methods, ΔSNP–index and G–value, were used to identify the quantitative trait loci (QTL) for mesocotyl elongation. A QTL named as, located in the region of 29.56–33.28 Mb on chromosome 3 were detected. After linkage analysis of 184 F2lines with the newly developed KASP markers based on this locus, the region was narrowed down to 28.89–31.03 Mb. Combining the results of gene annotation, linkage analysis, and gene expression analysis,,,,,,,andwere speculated to be candidate genes in this region. These genes were involved in the regulation of plant hormones as well as the mechanism of cell division. This study uncovers a locus related to rice mesocotyl elongation and is helpful for the breeding of long mesocotyl varieties.

mesocotyl; bulked segregant analysis; Δ(SNP-index); linkage analysis; candidate gene

10.3724/SP.J.1006.2021.02082

本研究由中國博士后科學基金項目(2020M68299)和中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程協(xié)同創(chuàng)新任務(CAAS-XTCX2016001)資助。

This study was supported by the China Postdoctoral Science Foundation (2020M68299) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program Cooperation and Innovation Mission of the Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-XTCX2016001).

王雅美, E-mail: wangyamei@caas.cn

E-mail: woshiyonghwa@163.com

2020-11-30;

2021-03-23;

2021-04-07.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210407.0922.004.html