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    去甲斑蝥素對人未分化甲狀腺癌FRO細胞遷移、侵襲影響及機制研究

    2021-08-05 10:03:14許景偉岳麗玲許瀚文
    現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志 2021年21期
    關鍵詞:去甲小室劃痕

    許景偉,樊 麗,岳麗玲,許瀚文

    (1. 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院,黑龍江 齊齊哈爾 161041;2. 齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;3. 天津醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院,天津 300270)

    甲狀腺癌是近年來頭頸部及內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,據(jù)2017年全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計,甲狀腺癌位居女性惡性腫瘤的第五位[1],其中未分化甲狀腺癌雖然只占甲狀腺癌的2%左右,但其惡性度極高,生長快、易轉移、預后差[2]。目前臨床上對未分化甲狀腺癌尚無有效的治療方法,是臨床亟待解決的問題。斑蝥是芫青科昆蟲南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas或黃黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的干燥蟲體[3]。2000年前,斑蝥素就已經(jīng)應用于抗腫瘤治療,但是其對泌尿系統(tǒng)有明顯毒副作用。去甲斑蝥素是在斑蝥素基礎上去掉1,2位甲基,保留了其抗腫瘤及提高白細胞活性的作用,且可明顯減輕對泌尿系統(tǒng)的毒性損傷作用[4]。本研究觀察了去甲斑蝥素對人未分化甲狀腺癌FRO細胞遷移和侵襲能力的影響及可能作用機制,旨在為其臨床應用提供更多實驗依據(jù)。

    1 實驗材料與方法

    1.1材料 人未分化甲狀腺癌FRO細胞(中科院上海生命研究院);去甲斑蝥素 (貴州金橋藥業(yè)有限公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青公司);CCK-8試劑盒、二甲亞砜(上海碧云天生物技術有限公司);E-鈣黏蛋白(E-cadherin)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)兔抗人一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(美國ABclonal公司);Transwell小室(美國Corning公司);細胞周期試劑盒(四正柏生物公司);Turnel細胞凋亡試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。

    1.2細胞培養(yǎng) 復蘇甲狀腺癌FRO細胞,并接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞貼壁生長后每2 d換液1次,生長達到90%孔底面積時經(jīng)胰酶消化傳代用于后續(xù)實驗。

    1.3細胞活性檢測 收集對數(shù)生長期的FRO細胞,加到96孔培養(yǎng)板中(5 000個/100 μL/孔);37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至細胞長滿孔底后吸出培養(yǎng)基,加入終濃度分別為2.5,5,10,20,40,80 μg/mL的去甲斑蝥素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),每個濃度設5個平行孔,分別于培養(yǎng)12 h、24 h、48 h取出培養(yǎng)板,用含10 μL CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h,酶標儀測定450 nm處每孔的吸光度(OD)值,計算細胞增殖抑制率[(對照孔A-實驗孔A)/(對照孔A-空白孔A)×100%]。

    1.4細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)生長期FRO細胞,分為空白組(只加培養(yǎng)基)、10 μg/mL去甲斑蝥素組、20 μg/mL去甲斑蝥素組、40 μg/mL去甲斑蝥素組,分組處理后,置于37 ℃、5% CO2箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,胰酶消化各組細胞,調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL并接種于6孔板內(nèi),每孔加入2 mL,至細胞達80%融合,在6孔板底板部位用滅菌的100 μL Tip頭做一字劃痕并做標記,洗凈脫落細胞及細胞碎片,用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于0 h、12 h和24 h后在倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)域細胞的遷移愈合情況并拍照,使用 Image J軟件計算細胞的遷移面積,用愈合率代表遷移能力。愈合率(%)=(0 h劃痕面積-12 h/24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

    1.5Transwell細胞侵襲實驗 Matrigel于4 ℃過夜融化,按Matrigel膠:無血清培養(yǎng)基1∶8的比例進行稀釋,取稀釋膠100 μL加入小室上室,置于培養(yǎng)箱中聚合凝固[5]。取對數(shù)生長期FRO細胞,調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL并接種于6孔板內(nèi),每孔加入2 mL,按1.4的方法進行分組處理,培養(yǎng)24 h后,常規(guī)消化后用無血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整各組細胞密度為2×106個/mL,取100 μL細胞懸液輕輕加人Transwell小室上室,下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基700 μL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄上室培養(yǎng)基,PBS洗2次,棉簽擦去上室的細胞,4%多聚甲醛固定30 min,晾干后用0.1%結晶紫染色30 min,晾干,在光學顯微鏡下觀察并拍照。隨機選取5個高倍鏡視野/孔,計數(shù)穿過小室底膜的細胞數(shù),取平均值。實驗重復3次。

    1.6流式細胞術細胞周期檢測 取對數(shù)生長期的FRO細胞,調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL并接種于6孔板內(nèi),每孔加入2 mL,按1.4的方法進行分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集細胞,用預冷的PBS漂洗細胞2次,制成單細胞懸液,滴加預冷的無水乙醇,至終濃度為70%,4 ℃固定過夜;固定后的細胞經(jīng)PBS漂洗2次,加入400 μL PI混勻,避光4 ℃染色30 min,流式細胞儀檢測分析細胞周期。實驗重復3次。

    1.7TUNEL法細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的FRO細胞,調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL并接種于96孔板內(nèi),每孔加入200 μL,待細胞貼壁后按1.4的方法進行分組處理,培養(yǎng)24 h后,4%多聚甲醛固定1 h,0.1% TritonX-100處理2 min。按照試劑盒說明書進行細胞凋亡染色,激光共聚焦觀察、拍照、分析實驗結果。

    1.8Western blot法E-cadherin和MMP-9表達檢測 取對數(shù)生長期的FRO細胞,按1.4的方法進行分組處理,置于37 ℃、5% CO2箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,300 μL預冷的細胞裂解液處理各組細胞1 h,4 ℃下13 000 r/min離心15 min,收集上清液,采用BCA法測定蛋白濃度,按每孔50 μg上樣進行SDS-PAGE分離蛋白,電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上,1%BSA,37 ℃封閉1 h,加入1∶1 000稀釋的E-cadherin和MMP-9單克隆抗體,室溫振蕩6 h,洗膜后熒光二抗避光孵育1 h,洗膜,發(fā)光。

    2 結 果

    2.1不同濃度去甲斑蝥素作用不同時間甲狀腺癌FRO細胞增殖抑制率 2.5,5,10,20,40,80 μg/mL的去甲斑蝥素處理FRO細胞12 h、24 h、48 h后, FRO細胞增殖抑制率均逐漸增高,具有劑量時間依賴性,見圖1。40 μg/mL的去甲斑蝥素作用24 h后,F(xiàn)RO細胞增殖抑制率為(50.21±4.98)%,達到半數(shù)致死率,故后續(xù)實驗選擇10,20,40 μg/mL的去甲斑蝥素干預。

    2.2各組甲狀腺癌FRO細胞遷移能力比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)12 h和24 h后劃痕愈合率均明顯低于空白組,且隨去甲斑蝥素濃度增加劃痕愈合率逐漸降低,各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖2。

    圖2 空白組和去甲斑蝥素各組甲狀腺癌FRO細胞劃痕實驗愈合率

    2.3各組甲狀腺癌FRO細胞侵襲能力比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后,隨去甲斑蝥素濃度增加,穿過Transwell小室的細胞數(shù)逐漸減少,各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖3。

    圖3 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細胞穿過Transwell小室的數(shù)量

    2.4各組甲狀腺癌FRO細胞周期比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后,隨去甲斑蝥素濃度增加,處于G2/M期的細胞比例顯著升高,G0/G1期的細胞比例顯著降低,各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖4及表1。

    圖4 流式細胞儀檢測空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細胞周期分布

    表1 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細胞周期分布情況

    2.5各組甲狀腺癌FRO細胞凋亡率比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后,隨去甲斑蝥素濃度增加,細胞凋亡率逐漸增高,各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖5。

    圖5 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細胞凋亡率

    2.6各組甲狀腺癌FRO細胞中E-cadherin和MMP-9表達情況比較 去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后,隨去甲斑蝥素濃度增加,E-cadherin表達量明顯上調(diào),MMP-9表達量明顯下調(diào),各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖6及圖7。

    圖6 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細胞中E-cadherin和MMP-9表達情況

    圖7 空白組和去甲斑蝥素各組培養(yǎng)24 h后甲狀腺癌FRO細胞中E-cadherin和MMP-9相對表達量比較

    3 討 論

    去甲斑蝥素是我國首先研制的人工合成的抗腫瘤藥物,不僅可以升高白細胞,還可以提高免疫系統(tǒng)的功能,臨床上主要用于消化系統(tǒng)腫瘤的治療,但其抗腫瘤作用的機制仍不明確[6]。

    惡性腫瘤細胞周期和凋亡紊亂而具有永生性,遷移和侵襲能力強,易轉移[7]。轉移多是惡性腫瘤晚期的共有表現(xiàn),也是導致患者死亡的主要原因[8]。未分化甲狀腺癌是惡性度最高的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤,病死率占甲狀腺癌的14.0%~39.0%,中位生存期不足半年,多數(shù)患者死于遠處轉移[9]。因此,在未分化甲狀腺癌治療中抑制腫瘤細胞的轉移是待解決的關鍵問題。本實驗結果顯示,去甲斑蝥素對FRO細胞生長有明顯的抑制作用,并呈時間劑量依賴性;劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示,去甲斑蝥素能夠抑制FRO細胞的遷移和侵襲能力,并呈劑量依賴性;流式細胞術結果顯示,去甲斑蝥素使FRO細胞周期阻滯在G2/M期,使進入G1期的細胞減少;TUNEL實驗顯示去甲斑蝥素可以促進FRO細胞凋亡,并具有劑量依賴性。

    腫瘤細胞的遷移和侵襲能力與轉移相關蛋白表達密切相關?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是依賴鋅和鈣來表達催化活性的內(nèi)源性蛋白酶家族,可以通過水解細胞外基質(zhì)中的蛋白成分,破壞細胞屏障,在腫瘤細胞侵襲轉移中起關鍵作用[10-11]。其中MMP-9屬于被糖化的分子量較大的Ⅳ型膠原酶,與腫瘤細胞的生長、轉移密切相關[12-13]。 E-cadherin是一種重要腫瘤侵襲轉移抑制基因,主要表達于上皮細胞表面,在維持細胞間黏附、細胞極性及正常組織結構中起到重要作用[14]。目前研究表明,細胞間黏附性降低是惡性腫瘤發(fā)生轉移的關鍵步驟,E-cadherin降低且表達于胞漿內(nèi),可致細胞間黏附性降低,促進腫瘤細胞轉移[15-16]。本實驗結果顯示,隨著去甲斑蝥素濃度增高,MMP-9表達量逐漸降低,E-cadherin表達量逐漸增高。

    綜上所述,去甲斑蝥素可抑制未分化甲狀腺癌細胞FRO的增殖、遷移及侵襲能力,可誘導FRO細胞周期發(fā)生G2/M期阻滯,誘導細胞凋亡,其機制可能與上調(diào)轉移相關蛋白E-cadherin表達、下調(diào)MMP-9表達有關,但具體調(diào)節(jié)機制尚待進一步研究。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

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