一株耐鹽微生物的分離鑒定及其對養(yǎng)殖尾水降解效果研究

夏楓峰，油九菊，洪志翔，傅榮兵，何映雪，余靖雯，張曉林

(1.浙江省舟山市水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316000；2.國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022)

隨著集約化海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國海水養(yǎng)殖的面積和密度不斷擴大，在海水養(yǎng)殖蝦類中凡納濱對蝦的養(yǎng)殖面積位居榜首。據(jù)2019 年漁業(yè)統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù)顯示，2018 年凡納濱對蝦的養(yǎng)殖面積為167 025 hm2，占所有海水養(yǎng)殖蝦類的69%[1]。目前，高密度池塘養(yǎng)殖是凡納濱對蝦最主要的養(yǎng)殖方式，雖然高密度養(yǎng)殖能夠帶來高產(chǎn)量和高收益，但由于養(yǎng)殖尾水中殘餌和糞便隨著養(yǎng)殖密度的增加而逐漸增多，從而導致水體的氨氮、COD 和總磷等有害物質(zhì)嚴重超標[2]，若不經(jīng)處理直接排放，將對海域生態(tài)環(huán)境造成嚴重污染，同時也會對海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來威脅。因此，有效處理高密度養(yǎng)殖尾水是海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的基本前提。

目前養(yǎng)殖尾水處理主要有物理、化學、生物等方法，其中物理和化學處理法由于成本高且容易產(chǎn)生二次污染，在實際應用中受到很大限制[3]。例如目前比較熱門的電化學氧化法以及化學劑絮凝法等，不僅運營成本高昂，且使用范圍受限制，僅適用于工廠化養(yǎng)殖車間，對于大面積的池塘養(yǎng)殖尾水的處理還達不到理想的效果[4]。因此，對于池塘養(yǎng)殖尾水的處理則更傾向于選擇成本低且對環(huán)境友好的生物處理。目前已有一些降解效果較好的菌種報道，但是尚缺乏能夠耐鹽的菌株[5-6]。因此，本文將篩選出一株耐鹽的微生物，通過分子生物學手段進行菌株鑒定和特性研究，同時將在實驗室條件下初步檢測該微生物對養(yǎng)殖尾水中氨氮、COD 和總磷的降解效果。

1 材料與方法

1.1 水樣采集和培養(yǎng)基、試劑配制

實驗用的養(yǎng)殖尾水取自舟山市定海盤峙水產(chǎn)養(yǎng)殖場凡納濱對蝦大棚養(yǎng)殖池。于凡納濱對蝦養(yǎng)殖密度最高的時期取養(yǎng)殖尾水約10 L 帶回實驗室，一部分用于分離微生物，一部分用于檢測降解效果。

微生物分離所用的培養(yǎng)基為LB 固體和液體培養(yǎng)基，用干凈的海水代替蒸餾水配制。培養(yǎng)基的成分為：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.4～7.6，加海水至總體積為1 L；固體培養(yǎng)基為上述配方中添加1.5%瓊脂粉。在LB 培養(yǎng)基中加入20%的甘油，用于菌種保存。所有的培養(yǎng)基配好后在121 ℃，103.4 kPa 條件下滅菌20 min。

實驗中檢測氨氮、COD 和總磷采用連華科技有限公司的氨氮、COD 和總磷檢測試劑盒(貨號：LHN2N3、LH-DE、LH-P1P2)，對應試劑的配方如下：

N1 試劑：將整瓶晶體粉末狀N1 全部倒入燒杯中，加入無氨水，攪拌溶解后，定容至100 mL，加入棕色試劑瓶中，貼好標簽；N2 試劑：將整瓶片狀N2-N 倒入燒杯中，加入50 mL 無氨水，攪拌溶解，充分冷卻至室溫。另將整瓶N2-KH 粉末試劑全部倒入燒杯中，加入少量無氨水，攪拌使其充分溶解，然后將此溶液在攪拌下徐徐注入充分冷卻的N2-N 溶液中，用水稀釋至100 mL，靜置5 h 以上，儲存于棕色聚乙烯瓶中，用橡皮塞或聚乙烯蓋蓋緊；LH-P1-100 試劑：將試劑全部加入燒杯，加入100 mL 蒸餾水并不斷攪拌，試劑全部溶解后裝瓶封存；LH-P2-100 試劑：將試劑全部加入燒杯，加入88 mL 蒸餾水并不斷攪拌，在攪拌中加入12 mL 分析純硫酸，試劑全部溶液后裝瓶封存；LH-D-100 試劑：將整瓶的晶體狀粉末試劑倒入燒杯中，加入75 mL 蒸餾水，在不斷攪拌下加入5 mL 分析純硫酸，直至全部溶解后備用；LH-E-100 試劑：將整瓶的晶體狀粉末試劑，全部溶解于500 mL 分析純硫酸中，不斷攪拌或隔夜放置，直至試劑全部溶解后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離及純化

養(yǎng)殖尾水經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾以富集海水中的微生物，濾膜上富集的微生物用無菌海水輕輕沖洗至一干凈的培養(yǎng)皿，取培養(yǎng)皿中含微生物的混合液均勻涂布在提前制備好的LB 固體平板上，若微生物濃度過大，則需要進行一定倍數(shù)的稀釋后再涂布，以得到單一的菌落。涂布好的固體平板置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12～24 h，待平板上長出肉眼可見的單菌落后，用無菌牙簽挑取單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液出現(xiàn)一定的渾濁，以備進一步鑒定和分析。每管單菌落從1 號開始分別進行連續(xù)編號。

1.2.2 分子生物學鑒定

利用細菌基因組提取試劑盒(全式金，貨號：EE101-01)提取每管菌液的基因組DNA，以基因組DNA 為模板，通過PCR 擴增菌株的16S rDNA，擴增引物為：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：CTACGGCTACCTTGTTACGA。PCR 產(chǎn)物通過膠回收試劑盒回收純化后送至上海生工生物科技有限公司測序。測得的序列通過NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的BLAST 進行同源性比對，對篩選的不同菌落進行鑒定。序列相似性大于96%即認為是同一屬，對篩選出的不同屬細菌進行標記并保種。

1.2.3 菌株的形態(tài)觀察和生理生化特征分析

取10 μL 菌液于載玻片中央，輕輕放上蓋玻片，不要產(chǎn)生氣泡，在顯微鏡(萊卡DM2000)下觀察細菌的形態(tài)和運動模式，并拍照記錄。同時在體視顯微鏡下觀察固體平板上的單菌落形態(tài)，并拍照記錄。

采用負染色法處理細菌并觀察結(jié)果，觀察分離的細菌是否有莢膜；同時對菌株進行革蘭氏染色，以確定細菌為革蘭氏陽性或陰性。

1.2.4 菌株的生長特性研究

1.2.4.1 生長曲線的測定

在無菌操作臺中取100 mL LB 液體培養(yǎng)基，加入至三角燒瓶中，移液槍取1 mL 菌液以1：100 的轉(zhuǎn)接比例加入至三角燒瓶，混合搖勻。于三角燒瓶中取3 mL 混合液加至5 mL EP 管中，標記為0，并記錄取樣時間。每隔1 h 取1 次樣，依次編號，每次取的樣品放在4 ℃冰箱暫存。所有的樣品用分光光度計測定600 nm處的吸光度。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.2.4.2 菌株在不同鹽度下的生長曲線測定

分別利用不稀釋、1 倍稀釋、2 倍稀釋和3 倍稀釋的海水配制的LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，依據(jù)1.2.4.1 的方法測得不同鹽度下的生長曲線。

1.2.4.3 菌株在不同溫度下的生長曲線測定

將轉(zhuǎn)接過的菌液分別置于37 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)，依據(jù)1.2.4.1 的方法測定不同溫度條件下菌株的生長曲線。

1.2.5 對養(yǎng)殖尾水中氨氮、COD 和總磷的降解效果研究

在養(yǎng)殖場收集的養(yǎng)殖尾水按照1：100 的體積比加入活性較好的菌液，分別測得加入菌液之前和菌液處理7 d 之后水樣的氨氮、COD 和總磷的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

從固體平板上一共挑取了10 個單菌落進行菌株鑒定，其中1 號和4 號測序失敗，5 號、7 號以及9 號克隆與弧菌Vibrio 相似性最高；2 號、3 號、6 號、8 號以及10 號克隆與交替假單胞菌屬Pseudoalteromonas相似性最高。由于弧菌為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病菌，因此將對分離到的交替假單胞菌進行進一步研究。

2.2 交替假單胞菌的生物學特征

2.2.1 形態(tài)和生理生化特征

分離到的交替假單胞菌在用無菌海水配制的LB 培養(yǎng)基中生長良好，固體平板上的細菌在37 ℃培養(yǎng)24 h 后出現(xiàn)單菌落，菌落呈圓形或橢圓形，顏色為暗黃色，中間厚兩邊薄，邊緣帶有透明光圈，表面光滑(圖1 A)。菌體細胞為短棒狀(圖1 B)，無芽孢，無莢膜(圖1 C)，有鞭毛，能在培養(yǎng)液中自由運動。細菌經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察呈紫色(圖1 D)，故分離到的交替假單胞菌為革蘭氏陽性。

圖1 菌落形態(tài)及菌液生理生化特征Fig.1 Colony morphology and physiological and biochemical characteristics

2.2.2 不同條件下的生長特性

通過生長曲線測定，該菌在接種后2～4 h 為指數(shù)生長期，接種后10 h 生長達到平臺期，OD600nm最大可達到0.95，不同時間點的生長曲線見圖2。菌液在不同稀釋倍數(shù)的海水中培養(yǎng)，測得不同海水鹽度下該菌的生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海水稀釋倍數(shù)越低，菌株的生長速度越快，并在接種后2～4 h 生長速度差異明顯(圖3)。由此可見，本研究分離的交替假單胞菌生長需要一定的鹽度，以正常海水鹽度最適合其生長。此外，測定了交替假單胞菌在2 種不同溫度下的生長曲線，由圖4 可知，以海水的鹽度分別在37 ℃和28 ℃條件下培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)條件下的生長速度要比28 ℃快，由此可知，該交替假單胞菌生長的最適條件為未稀釋海水鹽度和溫度為37 ℃。

圖2 交替假單胞菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of Pseudoalteromonas

圖3 不同稀釋倍數(shù)海水條件下的生長曲線Fig.3 Growth curves under different dilution multiples of seawater

圖4 不同溫度條件下的生長曲線Fig.4 Growth curve under different temperature conditions

2.2.3 對養(yǎng)殖尾水的處理效果

分離的交替假單胞菌以1：100 的比例加入到養(yǎng)殖尾水中，處理7 d，測定處理前后水體中的氨氮、COD和總磷的變化，結(jié)果見表1。

表1 交替假單胞菌處理7 天前后尾水中氨氮、COD 和總磷指標Tab.1 Index of ammonia nitrogen,COD and total phosphorus in tail water before and after 7 days of treatment

數(shù)據(jù)顯示，交替假單胞菌對于養(yǎng)殖尾水中的氨氮和COD 具有一定降解作用，在交替假單胞菌處理后，水樣的氨氮值下降了86%，水樣的COD 值下降了38%，但是對于總磷的處理沒有效果。因此，該交替假單胞菌對養(yǎng)殖尾水中的氨氮和COD 的降解有一定的效果，但是對總磷的降解效果不明顯。

3 討論

隨著養(yǎng)殖尾水污染海洋環(huán)境風險的加大，微生物修復技術(shù)成為研究熱點。本研究從高密度養(yǎng)殖尾水中分離篩選出了1 株能降解氨氮和COD 的交替假單胞菌，該菌株在28 ℃、200 r·min-1的條件下，對養(yǎng)殖尾水中的氨氮和COD 降解效果較為明顯，但對總磷的降解效果不明顯。

假交替單胞菌是屬于γ-變形菌綱的一類海洋特有細菌，在全球海洋廣泛分布。該屬的多樣性很高，目前該屬已有41 個種[7]。該屬菌株可分泌多種胞外酶(嗜冷酶、海藻酸裂解酶、幾丁質(zhì)酶和瓊膠酶等)以及胞外生物活性物質(zhì)(抗菌溶菌物質(zhì)、抗真菌物質(zhì)、溶藻物質(zhì)等)，在海洋生物地球化學循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，具有良好的生物化學應用前景[8]。

從生理生化性質(zhì)上看，該屬細菌可產(chǎn)生各種各樣的生物活性物質(zhì)，其中不產(chǎn)色素類群傾向于產(chǎn)生具有特殊活性的生物酶類或其他大分子物質(zhì)[9-10]，而產(chǎn)色素類群則更傾向于合成一些具有防污染活性[11]、抗菌活性的生物活性物質(zhì)[12-15]。目前關(guān)于交替假單胞菌的分離及功能已有不少報道，已分離的該類菌株主要在降解石油烴類污染物[16]、抑制弧菌等致病菌[17]以及脫氨氮[18-19]方面具有明顯效果。本研究分離篩選出1 株能夠降解海水養(yǎng)殖尾水中氨氮和COD 的交替假單胞菌株，但對總磷的降解效果不明顯，因此，關(guān)于該菌株對氨氮和COD 的降解最優(yōu)化條件以及降解機制還有待于進一步深入研究，同時也有必要篩選更多能夠降解尾水中總磷的菌株。