不同劑量10%水合氯醛在構(gòu)建大鼠脊髓半切模型中的麻醉效果比較*

趙興昌 宋世強(qiáng) 唐毓金 劉 佳

1 右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色市 533000； 2 邯鄲市中醫(yī)院； 3 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

動物脊髓半切模型主要用于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的研究，將生物組織材料植入半切模型內(nèi)[1]，觀察神經(jīng)再生及動物活動情況。麻醉是構(gòu)建脊髓半切模型成功的第一步，同時也是動物福利的要求。麻醉效果和安全性是保證實驗成功的重要步驟，如麻醉過淺、麻醉維持時間較短，則不能順利手術(shù)，同時也給動物造成痛苦；如麻醉過深、麻醉維持較長，則可能增加麻醉風(fēng)險及死亡率，故選擇合適的麻醉藥物、藥物給藥途徑、藥物劑量非常重要。水合氯醛在構(gòu)建脊髓半切模型實驗中應(yīng)用較為廣泛，具有麻醉誘導(dǎo)快、麻醉維持時間和復(fù)蘇時間可通過劑量調(diào)節(jié)等優(yōu)點[2]。但在查閱構(gòu)建脊髓半切模型實驗的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用10%水合氯醛腹腔麻醉時劑量存在差異[3-5]，因此，比較不同劑量10%水合氯醛在構(gòu)建大鼠脊髓半切模型時的麻醉效果，為科研人員動物實驗提供安全和有效的麻醉依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 麻醉藥物及其配制 水合氯醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2018091101)，天平稱取10g水合氯醛加入到90ml滅菌0.9%氯化鈉溶液中，搖勻至完全溶解，配制成10%水合氯醛溶液，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物 8周齡SPF級SD大鼠，體重230～250g，均為雄性，共73只，由湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0014。飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，室溫20～25℃，濕度50%～70%，飼料、水不受限制。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組:分組采用完全隨機(jī)化方法，將73只SD大鼠隨機(jī)分為三組，均使用10%水合氯醛溶液，3ml/kg組21只，3.5ml/kg組10只，4ml/kg組42只。

1.3.2 實驗操作步驟:(1)麻醉藥物腹腔注射。采用兩人操作法，一人抓取固定大鼠，保持頭低位，使內(nèi)臟上移，以免注射藥物時注入臟器，另一人持1ml注射器自下腹中線旁以45°角刺入腹腔后，將腹壁挑起，回抽無血后緩慢注入藥物。放回鼠籠，記錄動物活動及麻醉效果各項指征，待大鼠完全麻醉后行脊髓半切模型手術(shù)操作。(2)構(gòu)建脊髓半切模型(見圖1)。將大鼠取俯臥位固定于動物手術(shù)臺上，背部剃毛，碘伏消毒，鋪無菌單，觸摸肋骨為標(biāo)志，以胸椎第10棘突為中心做一長約2cm正中切口，依次切開皮膚、皮下組織，沿棘突正中切開筋膜和棘上韌帶，棘突兩側(cè)骨膜下鈍性剝離豎脊肌直到兩側(cè)關(guān)節(jié)突，顯露椎板，咬骨鉗咬除胸10棘突和椎板，暴露硬脊膜及脊髓。顯微鏡下以后正中靜脈為界線， 用眼科手術(shù)尖刀向右橫向切斷右半側(cè)脊髓，去除少許脊髓組織，將修復(fù)脊髓損傷生物材料支架植入，徹底止血后逐層縫合筋膜、皮下及皮膚。

圖1 構(gòu)建脊髓半切模型

1.3.3 麻醉觀察指征：(1)麻醉誘導(dǎo)時間：指10%水合氯醛腹腔注射后至完全麻醉狀態(tài)的時間。完全麻醉狀態(tài)表現(xiàn)為大鼠呼吸規(guī)則、角膜反射消失、肌肉松弛、刺痛肢體無反應(yīng)、夾尾反射消失等。(2)麻醉維持時間：指完全麻醉后持續(xù)的時間。至大鼠出現(xiàn)前肢微動、頭部活動即為進(jìn)入麻醉復(fù)蘇期。(3)麻醉復(fù)蘇時間：指大鼠從出現(xiàn)肢體微動、刺痛肢體有反應(yīng)、頭部活動到活動正常狀態(tài)所需要的時間。(4)麻醉時間：指10%水合氯醛腹腔注射時起至大鼠恢復(fù)到正?；顒訝顟B(tài)所需要的時間。(5)構(gòu)建脊髓半切模型時間：指大鼠完全麻醉后，從固定、剃毛、消毒、鋪單至手術(shù)完成時間。(6)麻醉死亡率：指各組麻醉后死亡例數(shù)占總體例數(shù)的百分率。

2 結(jié)果

2.1 麻醉誘導(dǎo)時間 3ml/kg組麻醉誘導(dǎo)時間(6.1±0.4)min；3.5ml/kg組麻醉誘導(dǎo)時間(4.4±0.2)min；4ml/kg組麻醉誘導(dǎo)時間(3.5±0.2)min。4ml/kg組起效時間最快，3ml/kg組起效時間最慢;且3ml/kg組與3.5ml/kg、4ml/kg兩組的麻醉誘導(dǎo)時間均存在明顯差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；3.5ml/kg、4ml/kg兩組的麻醉誘導(dǎo)時間差異不顯著(P>0.05)，見圖2。

圖2 麻醉誘導(dǎo)時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg不同劑量三組,組間多重比較，**P<0.001

2.2 麻醉維持時間 3ml/kg組麻醉維持時間(72±4)min；3.5ml/kg組麻醉維持時間(103±3)min；4ml/kg組麻醉維持時間(109±7)min。3ml/kg組麻醉維持時間最短，4ml/kg組麻醉維持時間最長。3ml/kg與3.5ml/kg兩組存在明顯差異(P=0.001),且3ml/kg、3.5ml/kg兩組均與4ml/kg組存在明顯差異(P<0.001)，見圖3。

圖3 麻醉維持時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三種不同劑量組，組間多重比較，*P=0.001,**P<0.001

2.3 麻醉復(fù)蘇時間 3ml/kg組麻醉復(fù)蘇時間(102±4)min；3.5ml/kg組麻醉復(fù)蘇時間(144±4)min；4ml/kg組麻醉復(fù)蘇時間(132±4)min。3ml/kg組麻醉復(fù)蘇時間最短，3.5ml/kg組麻醉復(fù)蘇時間最長。三組間兩兩比較均數(shù)均存在明顯差異(P<0.001)，見圖4。

圖4 麻醉復(fù)蘇時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三種不同劑量組，組間多重比較，**P<0.001

2.4 麻醉時間 3ml/kg組麻醉時間(180±5)min；3.5ml/kg組麻醉時間(251±6)min；4ml/kg組麻醉時間(245±8)min。3ml/kg組麻醉時間最短，3.5ml/kg組麻醉時間最長。3.5ml/kg與4ml/kg兩組無明顯差異(P>0.05),而3ml/kg組與3.5ml/kg組、4ml/kg組均存在明顯差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖5。

圖5 麻醉時間3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三種不同劑量組，組間多重比較，**P<0.001

2.5 構(gòu)建脊髓半切模型時間 三組共73只大鼠構(gòu)建脊髓半切模型方式、步驟相同，均在完全麻醉后，按固定、背部剃毛、術(shù)區(qū)消毒、鋪單、手術(shù)、包扎等步驟完成。造模時間平均用時(30±3)min，最長為38min，最短為26min。

2.6 麻醉死亡率 4ml/kg組42只大鼠中有2只麻醉死亡，死亡率為4.762%；3ml/kg組(21只)、3.5ml/kg組(10只)兩組均無死亡，死亡率均為0.000%；經(jīng)χ2檢驗得出P=0.468 2,故三組死亡率差異不顯著，見圖6。

圖6 死亡率

3 討論

脊髓損傷是一種高致殘率、高致死率的疾病，損傷后軸突再生障礙造成功能恢復(fù)困難[6]。脊髓損傷可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷指由外界暴力傷所致，而繼發(fā)性損傷為傷后發(fā)生的一系列自身過度反應(yīng)激活的相對破壞過程，原發(fā)損傷后脊髓缺血缺氧，會使溶酶體內(nèi)容物過度釋放以及鈣離子依賴的消化酶的激活，導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)一步壞死[7-8]。脊髓損傷區(qū)域挫傷、壓迫、出血甚至斷裂，在損傷較短時間甚至數(shù)小時內(nèi)軸突發(fā)生變性、壞死[9-10]，造成脊髓結(jié)構(gòu)及功能的損害，在受損脊髓的相應(yīng)節(jié)段以下出現(xiàn)各種運動、感覺和括約肌功能障礙，肌張力異常及病理反射等的相應(yīng)改變[11]，隨后脊髓水腫、缺血、炎癥因子的滲入、自噬啟動等均會造成微環(huán)境的改變使損傷區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大，過程可能持續(xù)3周，隨著軸突的變性，病情進(jìn)一步加重。在外力因素不能避免的情況下，目前重點集中在減輕繼發(fā)性損傷，縮短病程，減少損傷面積的進(jìn)一步擴(kuò)大，為軸突再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境，促進(jìn)軸突的生長或抑制膠質(zhì)瘢痕的形成[12-13]。 內(nèi)外性因素所致的脊髓損傷引起的神經(jīng)元大量變性、壞死是脊髓損傷的重要病理機(jī)制[14]。

構(gòu)建脊髓半切模型是研究生物組織材料修復(fù)神經(jīng)損傷常用的一種方式，模型具有直觀、易重復(fù)等優(yōu)點。構(gòu)建模型需要良好的全身麻醉，使大鼠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、肌松。而水合氯醛能達(dá)到這種效果，被廣泛應(yīng)用于動物實驗[15-17]。麻醉藥物的劑量要求適應(yīng)手術(shù)的需要，劑量少、效果好、復(fù)蘇快為優(yōu)選?，F(xiàn)將實驗過程中應(yīng)用10%水合氯醛不同劑量的麻醉效果總結(jié)如下：(1)三種不同劑量3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg均能滿足構(gòu)建脊髓半切模型手術(shù)需要，能產(chǎn)生良好的麻醉效果。(2)麻醉誘導(dǎo)時間：3.5ml/kg、4ml/kg兩種劑量麻醉誘導(dǎo)差異不明顯(P>0.05)，而與3ml/kg組均存在明顯差異，劑量越大麻醉誘導(dǎo)時間越短，4ml/kg麻醉誘導(dǎo)時間最短。(3)麻醉維持時間：完全麻醉后維持時間對構(gòu)建脊髓半切模型最為關(guān)鍵，是模型手術(shù)成功的前提。3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三組間差異顯著(P<0.05)，3ml/kg組麻醉維持時間最短，平均(72±4)min，但也能滿足構(gòu)建模型所需時間[平均用時(30±3)min，最長為38min，最短為26min]；相比3.5ml/kg[(103±3)min]、4ml/kg[(109±7)min]，3ml/kg劑量最為合適。(4)麻醉復(fù)蘇時間：3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三組不同劑量間差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。復(fù)蘇時間不隨劑量增大而延長，3ml/kg組復(fù)蘇時間最短(102±4min)，相比3.5ml/kg[(144±4)min]、4ml/kg[(132±4)min]，3ml/kg劑量最為合適。(5)麻醉時間：3.5ml/kg、4ml/kg兩組差異不明顯(P>0.05)，但均與3ml/kg劑量組存在顯著差異(P<0.001)。3ml/kg劑量麻醉時間最短[(180±5)min]，麻醉時間在滿足構(gòu)建模型的前提下，時間越短越安全，相比3.5ml/kg[(251±6)min]、4ml/kg[(245±8)min]，3ml/kg劑量最為合適。(6)麻醉死亡率：除4ml/kg組死亡2例外(死亡率4.762%)，3ml/kg、3.5ml/kg均無死亡(死亡率0.000%)，3ml/kg、3.5ml/kg兩組優(yōu)于4ml/kg組。

綜上所述，比較應(yīng)用10%水合氯醛3ml/kg、3.5ml/kg、4ml/kg三組不同劑量麻醉時，應(yīng)根據(jù)動物實驗所需時間而選擇，在滿足實驗的前提下，誘導(dǎo)快、維持時間短、復(fù)蘇快、麻醉時間短為首選，從而降低麻醉死亡率。3ml/kg劑量組誘導(dǎo)時間[(6.1±0.4)min]較3.5ml/kg組[(4.4±0.2)min]、4ml/kg組[(3.5±0.2)min]長約2min,對構(gòu)建脊髓半切模型進(jìn)程影響較小，但在麻醉維持、復(fù)蘇、麻醉時間、死亡率等方面均有優(yōu)勢。因此，10%水合氯醛3ml/kg劑量腹腔注射麻醉效果在構(gòu)建大鼠脊髓半切模型實驗中優(yōu)于3.5ml/kg、4ml/kg兩種劑量。