非通氣側(cè)肺持續(xù)中低流量給氧對(duì)患者肺泡巨噬細(xì)胞凋亡及自噬的抑制作用*

周俊輝，孟憲慧△，高 潔

(1.河南省胸科醫(yī)院麻醉科，鄭州 450008；2.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，鄭州 450003)

肺癌根治術(shù)中常用的單肺通氣(OLV)是一種非生理性呼吸模式，可為手術(shù)提供極大便利。但長(zhǎng)時(shí)間(>2 h)的OLV可能會(huì)導(dǎo)致術(shù)后發(fā)生低氧血癥、肺損傷甚至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，增加術(shù)后肺部并發(fā)癥(PPCs)發(fā)生率，影響患者臨床預(yù)后，尤其是老年患者更是如此。非通氣側(cè)肺萎陷和復(fù)張可引起缺氧復(fù)氧性肺損傷，再加上OLV期間機(jī)械通氣引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可造成明顯的急性肺損傷[1]。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)是ARDS及肺損傷的重要效應(yīng)細(xì)胞，在肺部炎性反應(yīng)及組織修復(fù)中有重要作用[2]。OLV后對(duì)非通氣側(cè)肺進(jìn)行持續(xù)給氧可改善OLV結(jié)束后肺的氧合功能，減輕食管切除術(shù)OLV結(jié)束后的全身和非通氣側(cè)肺的炎性和氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]；但其對(duì)非通氣側(cè)肺損傷時(shí)AM的凋亡及自噬有無(wú)影響尚少有相關(guān)研究證實(shí)。本研究擬探討OLV時(shí)非通氣側(cè)肺持續(xù)中低流量給氧對(duì)老年肺癌根治術(shù)患者非通氣側(cè)肺損傷時(shí)AM凋亡及自噬的影響，以期提供臨床參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1病例資料

本研究方案經(jīng)河南省胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意(倫理審批號(hào)：2019-02-011)，術(shù)前已征得患者及其委托人的同意，且簽署知情同意書(shū)。2019年4月至2020年5月于河南省胸科醫(yī)院手術(shù)室擇期行胸腔鏡下肺癌根治術(shù)的老年患者共60例，其中，男35例，女25例，年齡65～80歲，體重40～75 kg，身高150～185 cm。美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(ASA)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的肺部疾病；肝腎功能不全；癡呆癥，帕金森病，腦卒中，吸毒或長(zhǎng)期服用精神類(lèi)藥物；嚴(yán)重的心臟傳導(dǎo)阻滯，高血壓、冠心病和糖尿病；長(zhǎng)期服用類(lèi)固醇類(lèi)藥物、激素藥物；近期有重大手術(shù)史。剔除標(biāo)準(zhǔn)：圍術(shù)期發(fā)生不良事件如出血量大于600 mL；圍術(shù)期感染；麻醉時(shí)間大于5 h；再次手術(shù)。納入患者依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法被分成研究組和對(duì)照組，每組30例。

1.1.2試劑及藥物

丙泊酚(北京費(fèi)森尤斯卡比華瑞制藥有限公司)；舒芬太尼、瑞芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)，羅庫(kù)溴銨(浙江仙琚制藥股份有限公司)；右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；羥考酮[萌蒂(中國(guó))制藥有限公司]；羅哌卡因(英國(guó)阿斯利康制藥有限公司)；舒更葡糖鈉(荷蘭Organon公司)；Alex Fluor標(biāo)記的CD11b抗體、PE-Cy7標(biāo)記的Siglec F抗體和APC標(biāo)記的CD11c抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)一抗、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)-Ⅰ一抗、LC3-Ⅱ一抗和Beclin-1一抗(英國(guó)Abcam公司)；抗GAPDH一抗(美國(guó)CST公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1麻醉方法

患者術(shù)前禁飲禁食。入室后常規(guī)監(jiān)測(cè)心電圖、無(wú)創(chuàng)血壓及血氧飽和度。建立上肢外周靜脈通道，輸注乳酸鈉林格液6～8 mL/kg。局部麻醉下行橈動(dòng)脈穿刺置管并監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓。全麻誘導(dǎo)采用依托咪酯0.3 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg和羅庫(kù)溴銨0.6 mg/kg，選用35#(女性)或37#(男性)的可視化雙腔支氣管進(jìn)行氣管內(nèi)插管，機(jī)械通氣。行右側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺置管。麻醉維持采用全憑靜脈麻醉，靜脈泵注丙泊酚4.0～8.0 mg·g-1·d-1、瑞芬太尼0.05～0.20 μg·g-1·d-1、右美托咪定0.20～0.70 μg·g-1·d-1及羅庫(kù)溴銨0.3～0.6 mg·g-1·d-1。術(shù)中腦電雙頻指數(shù)(BIS)維持在40～60。雙肺通氣時(shí)潮氣量8 mL/kg，OLV時(shí)潮氣量6 mL/kg。吸入氧濃度為60%～80%，維持氧飽和度大于或等于92%。術(shù)中輸注平衡晶體液3 mL·g-1·d-1。術(shù)畢時(shí)4個(gè)成串刺激(TOF)值大于或等于0.9，則可拔除氣管插管；若TOF值小于0.9，則使用舒更葡糖鈉2 mg/kg進(jìn)行拮抗后拔除氣管插管。術(shù)畢前15 min靜脈注射羥考酮0.1 mg/kg，縫皮前手術(shù)切口皮下浸潤(rùn)注射0.25%羅哌卡因。患者術(shù)后送入麻醉后恢復(fù)室。

1.2.2干預(yù)措施

OLV后研究組從非通氣側(cè)肺置入長(zhǎng)度為65 cm的F14導(dǎo)管于氣管隆嵴分叉后2～3 cm，并給予1～4 L/min的持續(xù)性中低流量給氧；對(duì)照組非通氣側(cè)肺不給予持續(xù)性中低流量給氧，只置入F14導(dǎo)管于氣管隆嵴分叉后2～3 cm。

1.2.3血?dú)夥治?/p>

于麻醉誘導(dǎo)后即刻(T0)和OLV后 30 min (T1)、1 h (T2)及2 h (T3)時(shí)采集橈動(dòng)脈，采用GEM Premier 3000血?dú)夥治鰞x(美國(guó)IL公司)進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

1.2.4采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)

T3時(shí)在可視化雙腔支氣管的大、小套囊均鼓起的情況下對(duì)非通氣側(cè)肺進(jìn)行BALF采集。本操作由纖維支氣管鏡技術(shù)熟練者實(shí)施完成。選用BF-1T260型電子支氣管鏡(日本Olympus公司)，將其末端與兩組患側(cè)肺中葉或舌葉的葉支氣管開(kāi)口處緊密契合，將溫度為37 ℃的醫(yī)用生理鹽水緩慢注入，每次灌洗液量為40 mL，共3次，總量為200 mL，灌注后用50～100 mm Hg負(fù)壓吸引緩慢回收，回收率≥40%為回收成功，BALF經(jīng)雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，4 ℃冷卻10 min，再以3 000 r/min離心15 min，留取上清液，置于—20 ℃下以備后續(xù)檢測(cè)用。

1.2.5評(píng)價(jià)肺組織學(xué)

T3時(shí)切取已切除肺癌周邊正常的肺組織，置于4%中性甲醛溶液中進(jìn)行固定。固定好的肺組織進(jìn)行石蠟包埋，組織切片后用蘇木精和伊紅染色(HE)染色，并由對(duì)方案和研究組不知情的病理科醫(yī)師進(jìn)行SZ51光鏡(日本Olympus公司)檢測(cè)并進(jìn)行肺損傷評(píng)分的評(píng)估[4]。

1.2.6AM分選

利用Alex Fluor標(biāo)記的CD11b抗體、PE-Cy7標(biāo)記的Siglec F抗體和APC標(biāo)記的CD11c抗體來(lái)標(biāo)記人AM[CD11b(-)、CD11c(+)、Siglec F(+)]。從離心后的BALF中收集細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，加入抗體，避光冰浴30 min，向離心管中加入1 mL流式緩沖液終止染色，迅速離心去除上清液，將細(xì)胞重新用200 μL流式緩沖液懸起，通過(guò)細(xì)胞濾網(wǎng)后，使用MoFloAstrios EQ流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)進(jìn)行流式細(xì)胞分選。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AM凋亡

按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將分選出的AM與FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)孵育，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析AM的凋亡比例。

1.2.8Western blot檢測(cè)AM內(nèi)細(xì)胞凋亡和自噬標(biāo)志蛋白

AM內(nèi)總蛋白提取及蛋白濃度測(cè)定按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?？偟鞍纂娪巨D(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，Bcl-2一抗、Bax一抗、LC3-Ⅰ一抗、LC3-Ⅱ一抗和Beclin-1一抗(稀釋濃度均為1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶2 000)孵育4 ℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，ECL試劑發(fā)光顯影，Image J圖像分析系統(tǒng)獲取各條帶的吸光度值。AM內(nèi)Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)量，計(jì)算Bcl-2/Bax比值和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般臨床資料

兩組患者年齡、體重指數(shù)(BMI)、性別、ASA分級(jí)、術(shù)前第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)、雙肺通氣時(shí)間、PaO2、PaCO2、OLV時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、麻醉時(shí)間、出血量和輸液量等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般臨床資料的比較(n=30)

2.2 兩組患者不同時(shí)間點(diǎn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果

與T0時(shí)比較，T1～3時(shí)兩組PaO2均顯著下降(P<0.05)，PaCO2均顯著升高(P<0.05)。T1～3時(shí)研究組PaO2較對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)，PaCO2較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者不同時(shí)間點(diǎn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果的 比較

2.3 兩組患者肺組織病理學(xué)結(jié)果

對(duì)照組肺泡壁增厚、水腫，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)較多炎性滲出，肺間質(zhì)明顯增生可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。研究組肺泡間隔增寬，毛細(xì)血管未見(jiàn)明顯充血，小部分肺泡腔可見(jiàn)紅細(xì)胞及炎性滲出液，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，見(jiàn)圖1。

2.4 兩組患者肺損傷評(píng)分及AM凋亡率

T3時(shí)研究組肺損傷評(píng)分較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，研究組AM存活細(xì)胞率明顯升高(P<0.05)，AM早期凋亡率和晚期凋亡率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組患者肺損傷評(píng)分及AM凋亡率的比較

2.5 兩組BALF中AM內(nèi)Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)量及Bcl-2/Bax比值和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

與對(duì)照組比較，研究組AM內(nèi)Bcl-2、LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表4。

A：對(duì)照組；B:研究組。

圖2 兩組BALF中AM內(nèi)Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)量

表4 兩組BALF中AM內(nèi)Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)量及Bcl-2/Bax比值 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比較

3 討 論

OLV期間因機(jī)械通氣不足引起的肺不張、氧合功能下降、炎性反應(yīng)和肺損傷等均可導(dǎo)致患者肺臟的病理生理學(xué)變化[5]。OLV時(shí)非通氣側(cè)肺雖沒(méi)有氧合作用，但仍有血液供應(yīng)，肺血分流率(Qs/Qt)增加[6]。當(dāng)氧吸入濃度和血流動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)一致時(shí)，OLV時(shí)肺泡-動(dòng)脈氧分壓差(A-aDO2)較雙肺通氣時(shí)更大，且PaO2較雙肺通氣時(shí)更低。本研究結(jié)果表明，兩組患者在OLV后均具有不同程度的氧合功能下降，而OLV期間給予非通氣側(cè)肺持續(xù)性中低流量給氧則可改善OLV后氧合功能，顯著減少OLV后低氧血癥的發(fā)生，對(duì)肺組織起到有效的保護(hù)作用。

本研究參照文獻(xiàn)[7]，通過(guò)可視支氣管鏡下以1～4 L/min的流速持續(xù)性中低流量給氧，可顯著地改善氧合功能，但不影響手術(shù)操作，該方法稱(chēng)為非通氣側(cè)肺持續(xù)性給氧。非通氣側(cè)肺持續(xù)給氧可改善OLV期間的氧合功能并降低Qs/Qt[8]。本研究結(jié)果顯示，研究組肺損傷評(píng)分較對(duì)照組明顯降低，提示術(shù)中非通氣側(cè)肺持續(xù)中低流量給氧可減輕非通氣側(cè)肺損傷，這與其可改善患者氧合功能有關(guān)。OLV誘發(fā)肺損傷的機(jī)制非常復(fù)雜，包括機(jī)械通氣、低氧血癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。本研究結(jié)果顯示，OLV期間給予非通氣側(cè)肺持續(xù)性中低流量給氧則可減少低氧血癥，故其對(duì)OLV誘發(fā)的肺損傷亦有一定的減輕作用。

細(xì)胞凋亡在再灌注肺損傷中扮演著重要角色[10]。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族成員，主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，前者為抑凋亡蛋白，而后者為促凋亡蛋白[11]。因此，本研究通過(guò)Bcl-2/Bax比值來(lái)反映AM凋亡程度。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，研究組AM凋亡率明顯降低，而B(niǎo)cl-2/Bax比值升高，提示，術(shù)中非通氣側(cè)肺持續(xù)中低流量給氧可減輕非通氣側(cè)肺損傷，而細(xì)胞凋亡的抑制在其中具有重要作用。另外，細(xì)胞自噬與再灌注肺損傷的關(guān)系也較為密切[12]。Beclin-1是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，是自噬啟動(dòng)的標(biāo)志性基因測(cè)定，Beclin-1表達(dá)可以預(yù)測(cè)自噬的發(fā)生情況[13]。LC3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬體標(biāo)記蛋白，調(diào)控微管蛋白的組裝和去組裝，參與自噬體形成[14]。Beclin-1和LC3目前最常用來(lái)檢測(cè)自噬水平。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)LC3和 Beclin-1蛋白表達(dá)量來(lái)反映AM自噬程度。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，研究組AM內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表達(dá)下調(diào)，提示術(shù)中非通氣側(cè)肺持續(xù)中低流量給氧可減輕非通氣側(cè)肺損傷，而細(xì)胞自噬的抑制在其中具有重要作用。然而，由于自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系復(fù)雜，二者可由細(xì)胞外因素如缺氧、氧化應(yīng)激和局部缺血再灌注傷害等觸發(fā)刺激。因此，AM凋亡與自噬之間的失衡可能有助于非通氣側(cè)肺損傷發(fā)生，而這需要進(jìn)一步研究以探討術(shù)中非通氣側(cè)肺持續(xù)中低流量給氧與細(xì)胞凋亡及自噬之間的關(guān)系。