非新鮮腹瀉糞便樣本艱難梭菌檢測方法的研究*

王 浦，陳 燁

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科/廣東省南方消化疾病研究所，廣州 510515)

臨床上大劑量、多療程使用廣譜抗生素，以及激素、免疫制劑等濫用[1],破壞正常腸道菌群平衡,艱難梭菌(CD)趁勢迅速生長，產(chǎn)生毒素破壞腸黏膜屏障，引起艱難梭菌感染(CDI)及偽膜性腸炎，導(dǎo)致細(xì)菌易位，膿毒血癥，甚至多器官功能衰竭，給臨床帶來了極大的壓力與醫(yī)療支出[2-4]。

CD檢測方法有多種，但因培養(yǎng)條件及技術(shù)要求高、耗時長，不能用于臨床常規(guī)檢測[5]。目前，國內(nèi)外臨床廣泛采用酶免疫學(xué)試驗(yàn)(EIA)，針對艱難梭菌A或B毒素進(jìn)行檢測，可在2 h內(nèi)快速完成測定。但該方法存在交叉反應(yīng)、假陽性率高、特異度差[6- 7]。臨床診療過程中，常常發(fā)現(xiàn)假陰性的例子，從而延誤患者的治療。利用分子生物學(xué)PCR 技術(shù)可檢測CD毒素基因，但不適合應(yīng)用于基層醫(yī)院及現(xiàn)場快速檢測。因此，尋找新型的穩(wěn)定性好、特異度高并且方便快捷的檢測手段一直是研究熱點(diǎn)[8-13]。GeneXpert C.difficile熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Cepheid,GX-XVI)可以特異性的檢測艱難梭菌tcdB基因，整合了傳統(tǒng)PCR檢測所需的3個步驟(樣品制備、擴(kuò)增和檢測)，全程自動化，方便快捷。研究表明，該技術(shù)檢測新鮮糞便標(biāo)本CD，靈敏度好、特異度高，是一種應(yīng)用前景很廣泛的CD檢測技術(shù)[13-16]。

CD常規(guī)要求糞便標(biāo)本取樣后30 min內(nèi)檢測，因此局限了檢測區(qū)域，不利于大范圍開展檢測及常規(guī)篩查。此外，有些醫(yī)療機(jī)構(gòu)不具備CD檢測設(shè)備及技術(shù)，標(biāo)本需凍存后寄往相關(guān)單位進(jìn)行檢測，也可能影響檢測結(jié)果[6]。本研究的目的是尋找一種快速有效的非新鮮腹瀉糞便標(biāo)本CD檢測技術(shù)，通過比較GX-XVI及EIA對凍存標(biāo)本檢測的優(yōu)劣，提高凍存標(biāo)本的檢測水平，以期快速、便捷、準(zhǔn)確的用于臨床檢測、篩查、鑒定及預(yù)防CDI，擴(kuò)大CD檢測覆蓋范圍，對于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)合理選擇用藥、提高療效、減緩細(xì)菌耐藥及控制院內(nèi)感染[17]，減輕醫(yī)療壓力，具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

標(biāo)本來源于2014年2月到2019年2月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院住院患者共200份新鮮腹瀉糞便標(biāo)本(排出后立即取樣，厭氧運(yùn)送，0.5 h內(nèi)接種或保存)。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲的住院患者；60 d內(nèi)接受過抗生素治療或化療等藥物治療，住院后48 h后出現(xiàn)腹瀉，且24 h內(nèi)腹瀉次數(shù)≥3次，不成形大便(布里斯托分類5～7級)。排除標(biāo)準(zhǔn)：各種類型的感染性腹瀉，如細(xì)菌性痢疾、傷寒、食物中毒、原發(fā)性腹膜炎和阿米巴痢疾等；腸道功能性疾病，如腸易激綜合征等；其他有除抗生素以外明確原因的腹瀉，如乳糖不耐受等。剔除標(biāo)準(zhǔn)：因儀器或人為因素導(dǎo)致無法完成整個試驗(yàn)過程的樣本；病例資料不全的樣本。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核并通過(NFEC-2014-078)。

1.2 主要試劑及儀器

CD標(biāo)準(zhǔn)菌株 (VPI10463)來自蘭州微生物研究所饋贈。難辨梭菌瓊脂基礎(chǔ)，難辨梭菌培養(yǎng)基選擇添加劑，Eugon肉湯等CD液體、固體培養(yǎng)基及添加劑，購自BD及OXOID公司。厭氧指示劑，API20A 快速生化鑒定試劑盒及革蘭染色液套裝，艱難梭菌毒素A/B 檢測試劑盒購自生物梅里埃公司。保存液：甘油與Eugon肉湯按3/7比例混合。

1.3 方法

1.3.1糞便標(biāo)本處理

取新鮮腹瀉糞便標(biāo)本，按標(biāo)準(zhǔn)操作流程(SOP)，行CD分離培養(yǎng)及生化鑒定，PCR鑒定毒素。剩余糞便標(biāo)本加凍存液(1∶1)-80 ℃低溫冰箱保存1年以上。檢測時，快速解凍，4 ℃靜置24 h，然后分別采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(CCTA)、GX-XVI和EIA檢測CD。

1.3.2新鮮糞便標(biāo)本CD分離培養(yǎng)及生化鑒定

2 mL Eugon肉湯加入約0.2 mL新鮮糞便樣本，混勻；把大便懸浮液放在水浴鍋上80 ℃加熱10 min，然后降溫到室溫，放置5 min，取1滴加入艱難梭菌選擇液體培養(yǎng)基(CCMB-TAL)液體培養(yǎng)管中，35 ℃厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后觀察顏色變化,如CCMB-TAL培養(yǎng)基變色，表明可能有CD存在。另外吸取50 μL懸浮液加于新鮮配制的艱難梭菌選擇瓊脂(CCFA-HT)平板中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。如觀察到粗糙、邊緣不整齊疑似菌落，則純分后接種至普通血平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。如耐氧試驗(yàn)無須氧菌生長，則革蘭染色涂片，油鏡下如看到較粗的革蘭染色陽性，部分次極端有芽孢者懷疑為CD。取此單個菌落接種至血平板，以API20A行生化鑒定。經(jīng)生化鑒定后確定CD標(biāo)本，進(jìn)一步采用PCR技術(shù)檢測CD毒素。

1.3.3CCTA檢測非新鮮糞便標(biāo)本CD

解凍及靜置24 h后糞便標(biāo)本，按上述流程CMB-TAL培養(yǎng)5 d。取上述CMB-TAL培養(yǎng)基上清液，PBS稀釋，20 mL的上清液轉(zhuǎn)移到成纖維細(xì)胞，37 ℃，96孔板，5%二氧化碳環(huán)境，含有熱滅活10%胎牛血清的Eugon肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞毒效應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463作為陽性對照。

1.3.4GX-XVI檢測非新鮮糞便標(biāo)本CD

操作方法嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

1.3.5EIA檢測非新鮮糞便標(biāo)本CD

使用艱難梭菌毒素A/B檢測試劑盒檢測CD毒素，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6結(jié)果分析

比較新鮮及非新鮮糞便標(biāo)本CD檢出陽性率，評估凍存及解凍后靜置對檢出率的影響。比較GX-XVI、EIA對非新鮮標(biāo)本CD的檢測，評價其檢測效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。分類計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，GX-XVI、EIA與CCTA的一致性采用McNemar及Kappa系數(shù)分析。GX-XVI及EIA的敏感度、特異度、約登指數(shù)(Youden)，陽性似然比及陰性似然比采用MedCalc13進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新鮮糞便標(biāo)本CD鑒定及菌株分離

200份新鮮腹瀉糞便標(biāo)本經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)SOP富集培養(yǎng)，PCR毒素鑒定，最終得到70例產(chǎn)毒CD菌株，見圖1。

A：偽膜性腸炎結(jié)腸鏡圖片，內(nèi)鏡下可見乙狀結(jié)腸散在淡黃色偽膜，黏膜充血易脆；B：偽膜性腸炎病理圖片(100×)，黏膜固有層中性粒細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞破損，黏膜表面有分泌物；C：CD臨床分離菌株，革蘭陽性桿菌(Gram，1 000×)；D：艱難梭菌 A/B 毒素基因(tcdA/tcdB)PCR 擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；M：分子量標(biāo)準(zhǔn)1 000 bp；tcdA：546 bp；tcdB：204 bp。

2.2 非新鮮糞便標(biāo)本CD陽性率比較

非新鮮糞便標(biāo)本分別采用CCTA、GX-XVI和EIA檢測CD。CCTA提示CD毒素陽性標(biāo)本數(shù)為68份，與新鮮糞便標(biāo)本培養(yǎng)鑒定結(jié)果無差異(P=0.833，95%CI：0.692～1.579)。解凍后3種檢測方法陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.799，P=0.033)，見表1。

表1 解凍后3種檢測方法陽性率比較

2.3 非新鮮糞便標(biāo)本GX-XVI與CCTA檢測結(jié)果比較

非新鮮糞便標(biāo)本經(jīng)GX-XVI檢測確定65例毒素陽性標(biāo)本。62例(31.0%)標(biāo)本為真陽性，129例(64.5%)為真陰性。與CCTA相比，經(jīng)配對計(jì)量資料McNemar檢驗(yàn)，兩種診斷結(jié)果無明顯差異(P=0.508)，吻合系數(shù)Kappa=0.899，見表2。

表2 非新鮮樣本GX-XVI與CCTA陽性情況比較(n)

2.4 非新鮮糞便標(biāo)本EIA與CCTA檢測結(jié)果比較

非新鮮糞便標(biāo)本經(jīng)毒素EIA測定，陽性標(biāo)本56例。52例(26.0%)標(biāo)本為真陽性，128例(64.0%)為真陰性。與CCTA相比，經(jīng)配對計(jì)量資料McNemar檢驗(yàn)，兩種診斷結(jié)果有明顯差異(P=0.001)，吻合系數(shù)Kappa=0.516，見表3。

表3 非新鮮樣本EIA與CCTA陽性情況比較(n)

2.5 一致性分析

采用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件MedCalc13進(jìn)行分析，結(jié)果表明，對于非新鮮糞便標(biāo)本，與CCTA相比，GX-XVI檢測的靈敏度 91.18%(95%CI：81.8%～96.7%)，特異度97.73%(95%CI：93.5%～99.5%)，約登指數(shù)73.5%，陽性似然比40.12(95%CI：13.1～123.1)，陰性似然比0.090(95%CI：0.04～0.20)。相應(yīng)地，EIA檢測非新鮮糞便標(biāo)本CD靈敏度76.5%，特異度97.0%，約登指數(shù)73.5%。陽性似然比25.5，陰性似然比為0.242。

3 討 論

分析臨床CD檢測陽性率低的原因，可能和標(biāo)本未能及時送檢，以及臨床EIA檢測技術(shù)敏感性不足有關(guān)，因此，設(shè)計(jì)本研究尋找能提高臨床CDI診斷陽性率及準(zhǔn)確率的方法。采用凍存1年以上的腹瀉糞便標(biāo)本(凍存前已行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)及鑒定)，復(fù)蘇后4 ℃靜置24 h，然后CCTA檢測CD，結(jié)果表明長時間凍存及低溫靜置對CD檢出率無明顯影響。

分別采用GX-XVI及EIA對復(fù)蘇及靜置后糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CCTA相比，GX-XVI檢測CD靈敏度為91.18%，漏診少，特異度97.73%，說明GX-XVI確定非患者的能力好，誤診少。Kappa值為0.899，基本達(dá)到與CCTA檢測結(jié)果相一致的水平。約登指數(shù)88.90%，說明儀器診斷真實(shí)程度高，篩查能力強(qiáng)。陽性似然比為40.12，遠(yuǎn)大于10.00，說明GX-XVI能正確診斷非新鮮糞便樣本CD可能性大。GX-XVI陰性似然比為0.09，遠(yuǎn)小于1，錯誤判斷陰性的可能性小。EIA檢測非新鮮標(biāo)本，特異度高，但靈敏度較差，容易出現(xiàn)假陰性，與CCTA結(jié)果一致性差。EIA特異度較高的原因，可能與標(biāo)本長期凍存，以及靜置后雜菌死亡相關(guān)(CD在極端條件下形成芽孢，生存能力較強(qiáng))，交叉反應(yīng)概率變小。

因此，對于收集后不能立即送檢的糞便標(biāo)本，采用GX-XVI熒光定量PCR進(jìn)行檢測，靈敏度好，特異度高，與CCTA檢測結(jié)果一致性好。且GX-XVI可同時檢測二元毒素基因及tcdC基因nt117位點(diǎn)缺失，對于監(jiān)測B1/NAP1/027暴發(fā)流行極為有意義。GX-XVI從準(zhǔn)備樣品到出結(jié)果，全程自動，對工作環(huán)境和操作人員無特殊要求，1 h內(nèi)就能檢測出結(jié)果，可以做到及時隔離治療CDI患者。同時避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)分離鑒定及EIA檢測過程中研究人員與傳染性病原體長期接觸，有效保護(hù)了醫(yī)務(wù)人員及科研人員身體健康，減少暴發(fā)流行危險(xiǎn)[13,18]。最后，GX-XVI大約需要50 min即可得出結(jié)果，方便快捷，適合大范圍的檢測。

綜上所述，GX-XVI可以用于大范圍的CDI診斷，有望用于臨床 CDI的篩查。對于預(yù)防CDI，指導(dǎo)臨床合理選擇用藥，提高基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)CDI診療效率，減緩細(xì)菌耐藥，控制院內(nèi)感染播散，減輕醫(yī)療壓力具有重要意義，可作為臨床CDI常規(guī)篩查儀器。如果沒有該設(shè)備，或者缺乏熒光定量PCR技術(shù)條件，可考慮采用普通PCR結(jié)合EIA檢測非新鮮糞便標(biāo)本，彌補(bǔ)普通PCR特異度不足的問題。