6-甲基香豆素對乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響*

齊曉婭，鐘 珊，王 晴，白瑞雪，陳 曜△

[1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院健康管理(體檢)中心 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染病科 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400010]

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科家族中的一員，其感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計，全球約3.5億人為HBV慢性感染者，每年約有78.6萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重疾病[1]。目前被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于慢性乙型肝炎(CHB)治療的藥物為干擾素α(IFN-α)及5種核苷(酸)類似物。IFN-α可以通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮其抗病毒作用[2]，但因其應(yīng)答率低，不良反應(yīng)明顯且價格昂貴等缺點(diǎn)，使用范圍受到限制[3]。核苷(酸)類似物作為首選的抗病毒治療藥物，具有較強(qiáng)地抑制病毒DNA的能力[2]。但是核苷(酸)類似物需長期服藥，可能導(dǎo)致HBV聚合酶變異而引起耐藥，限制了其發(fā)展[4]。目前，現(xiàn)有的藥物均不能有效且全面地抑制HBV復(fù)制和HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的形成。因此迫切需要研發(fā)具有全新作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)的抗HBV藥物來解決這一問題。

香豆素類化合物是廣泛存在于自然界的一類芳香族化合物，分布于許多花草植物中。研究表明，香豆素類化合物具有多種生物學(xué)活性，如:抗艾滋病[4]、抗癌[5]、抗炎、抗凝血等。有文獻(xiàn)報道，多種香豆素類化合物在保肝、護(hù)肝及抑制HBV感染中起重要作用。7,8-二羥基-6-甲氧基香豆素是從秦皮中提取的天然產(chǎn)物，具有顯著的肝保護(hù)和抗纖維化作用[6]。扶芳藤中分離出的香豆素類化合物七葉亭(esculetin)在體內(nèi)外均可有效抑制HBV復(fù)制[7]。龍葵提取物香豆素(東莨菪內(nèi)酯)和酰胺[N-(對-反-香豆?；?]酪胺對HBV感染的肝癌細(xì)胞中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌有阻斷作用，說明香豆素類化合物生物堿具有抗HBV活性[8]。6-甲基香豆素(6-Methylcoumarin)屬于香豆素類化合物，常作為香料或添加劑，在化妝品、殺蚜劑、煙用添加劑等領(lǐng)域使用。隨著研究的深入，6-甲基香豆素在醫(yī)療領(lǐng)域的潛在價值被發(fā)現(xiàn)。6-甲基香豆素作為光敏劑，是人和豚鼠光敏性接觸性皮炎的重要誘因，紫外線在此過程中起催化作用[9]。同時，6-甲基香豆素可以作為模板分子參與分子印跡聚合物微球與共聚微球的制備[10]。更重要的是，6-甲基香豆素在抑制細(xì)胞生長及抗癌方面發(fā)揮了重要作用。有文獻(xiàn)報道馬纓丹鮮葉水提物中的6-甲基香豆素是抑制水葫蘆生長的重要化合物[11]。6-甲基香豆素對人食管癌Ec-109細(xì)胞的增殖和遷移有抑制作用，且其聯(lián)合紫杉醇后，抑制作用更為顯著[12]。然而，6-甲基香豆素在HBV感染中的作用尚未有研究報道。

本研究采用HBV穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞和HBV感染細(xì)胞模型HepG2-NTCP細(xì)胞及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究6-甲基香豆素在HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2.2.15細(xì)胞購自美國ATCC公司；HepG2-NTCP細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清，DMEM 高糖型培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素購自美國Hyclone公司；6-甲基香豆素購自美國Sigma公司；MTT試劑購自中國生工生物公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、血清病毒基因組DNA提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒購自中國天根生化科技公司；SYBR GREEN購自美國Bio-Rad公司；ELISA檢測試劑盒[HBsAg和乙型肝炎e抗原(HBeAg)]購自上?？迫A生物工程股份有限公司；SPF級HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6)，雄性，體重(17±2)g，6～8周齡，由廈門大學(xué)提供；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、400 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基中，HepG2-NTCP細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。以上細(xì)胞均在含5% CO2、37 ℃的孵箱中培養(yǎng)。分別設(shè)置陰性對照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組，分別采用含0.1% DMSO的生理鹽水(陰性對照組)，不同濃度的6-甲基香豆素(5、10、20 μmol/L，實(shí)驗(yàn)組)和采用25 nmol/L的恩替卡韋(陽性對照組)進(jìn)行處理，6 d后檢測HBV相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2HepG2-NTCP細(xì)胞感染HBV

取2.5×105個/孔的HepG2-NTCP細(xì)胞接種于12孔板中。培養(yǎng)1 d后，換為感染培養(yǎng)基。感染培養(yǎng)基處理1 d后，進(jìn)行感染，感染復(fù)數(shù)為1 000。感染后1 d，PBS清洗細(xì)胞3次，洗去殘留病毒顆粒，并進(jìn)行藥物處理。

1.2.3動物實(shí)驗(yàn)

HBV轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境。選取15只體重及HBV DNA拷貝數(shù)相近的雄性小鼠分為對照組(0.1% DMSO的生理鹽水組)，實(shí)驗(yàn)組(6-甲基香豆素組)和恩替卡韋(ETV)組(陽性對照組)，每組5只。3組分別為6-甲基香豆素溶于DMSO，并用生理鹽水稀釋1 000倍。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)組(6-甲基香豆素組)給藥劑量為5 mg，陽性對照組(ETV組)給藥劑量為0.02 mg，陰性對照組注射含0.1% DMSO的生理鹽水，采用腹腔注射的方式給藥，每2天給藥1次，每6天采血及稱重1次。24 d后處死小鼠，解剖并收集肝臟。

1.2.4MTT法檢測6-甲基香豆素的細(xì)胞毒性

將2×104個/孔的HepG2.2.15細(xì)胞和HepG2-NTCP細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)1 d后，加入不同濃度的6-甲基香豆素(倍比稀釋，從200 μmol/L至1.56 μmol/L)處理，每3 天更換1次含藥培養(yǎng)基。6 d后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，避光培養(yǎng)4 h。去除上清液，每孔加入100 μL DMSO充分溶解，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5RT-qPCR檢測HBV RNA表達(dá)水平

使用TRIzol法提取細(xì)胞和小鼠肝臟組織的總RNA，取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。RT-qPCR檢測HBV RNA的表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參。HBV RNA上游引物序列為5′-ACC GAC CTT GAG GCA TAC TT-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-GCC TAC AGC CTC CTA GTA CA-3′；內(nèi)參 β -actin上游引物序列為 5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔并重復(fù)3次。

1.2.6RT-qPCR檢測HBV DNA表達(dá)水平

0.5 mL裂解緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA、1% NP-40和2% sucrose]于37 ℃裂解細(xì)胞15 min，離心去除細(xì)胞碎片；加入5 μL的1 mol/L MgCl2和4 μL的 1×105U/L DNase Ⅰ，37 ℃孵育4 h；加入200 μL 35% PEG-8000，冰浴1 h；4 ℃ 12 000×g離心5 min，棄上清液；加入500 μL蛋白酶K消化液[0.5% SDS、150 mmol/L NaCl、25 mmol /L Tris-HCl (pH 8.0)和10 mmol /L EDTA]和終濃度為500 mg/L的蛋白酶K，45 ℃孵育過夜后進(jìn)行酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌，最后使用ddH2O溶解HBV DNA。

小鼠血清HBV DNA提取按照血清病毒基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行；小鼠肝臟組織HBV DNA提取按照基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞中HBV DNA的上游引物序列為5′-CCT AGT AGT CAG TTA TGT CAA C-3′，下游引物序列為 5′-TCT ATA AGC TGG AGG AGT GCG A-3′；小鼠血清和肝臟組織中HBV DNA的上游引物序列為5′- CCT CTT CAT CCT GCT GCT-3′，下游引物序列為5′-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3′。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔并重復(fù)3次。

1.2.7ELISA檢測HBsAg和HBeAg表達(dá)水平

ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液和小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平。藥物處理后，在指定時間收集細(xì)胞上清液和小鼠血清，按照說明書進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀測定450 nm處A值。

1.2.8酶標(biāo)法檢測血清AST和ALT

小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平采用酶標(biāo)法(賴氏法)檢測。試劑盒購自江蘇建成生物工程研究所，ALT檢測試劑盒(貨號：C009-2)和AST檢測試劑盒(貨號：C010-2)。將全血標(biāo)本1 000 r/min離心10 min，分離血清；血清樣品與基質(zhì)緩沖液在37 ℃下混合30 min；然后加入顯色液2，4-二硝基苯肼在37 ℃孵育20 min；隨后加入終止液0.4 mol/L NaOH，室溫靜置5 min，酶標(biāo)儀測定510 nm處A值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 6-甲基香豆素對細(xì)胞活性的影響

6-甲基香豆素在HepG2.2.15和HepG2-NTCP細(xì)胞中的CC50>200 μmol/L，見圖1。

2.2 6-甲基香豆素對HepG2.2.15細(xì)胞中HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響

6-甲基香豆素呈濃度依賴性地抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA和HBV RNA的水平，20 μmol/L濃度的6-甲基香豆素對HBV DNA和HBV RNA的抑制率分別為48.33%(圖2A)和58.87%(圖2B)；ETV能夠顯著抑制HBV DNA水平，但對HBV RNA無明顯影響。6-甲基香豆素呈濃度依賴性地降低HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的水平，20 μmol/L濃度的6-甲基香豆素對HBsAg和HBeAg的抑制率分別為38.33% (圖2C)和31.67% (圖2D)；ETV組HBsAg和HBeAg水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 6-甲基香豆素對HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響

6-甲基香豆素能夠顯著抑制細(xì)胞中HBV DNA和HBV RNA的表達(dá)，20 μmol/L的6-甲基香豆素對HBV DNA和HBV RNA的抑制率分別為41.67%和45.33%；ETV同樣能夠顯著抑制HBV DNA水平，而對HBV RNA無明顯影響。同時，ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，6-甲基香豆素可有效降低HepG2-NTCP細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平，20 μmol/L的6-甲基香豆素對HBsAg和HBeAg的抑制率分別為29.67%和37.00%；ETV組HBsAg和HBeAg的水平無明顯變化，見圖3。

2.4 6-甲基香豆素對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的抗病毒效能

3組小鼠體重未出現(xiàn)異常的增高或降低(圖4A)，ALT、AST均無明顯變化(圖4B、C)。與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠血清中HBV DNA的拷貝數(shù)減少，且抑制效果隨著時間的延長而增強(qiáng)；ETV組小鼠血清中的HBV DNA拷貝數(shù)降低(圖4D)。與對照組相比，試驗(yàn)組血清中HBsAg和HBeAg的水平持續(xù)降低，抑制率分別為51.80%和42.80%，而ETV組HBsAg和HBeAg水平變化不明顯(圖4E、F)。與對照組相比，試驗(yàn)組和ETV組肝臟組織HBV DNA均被明顯抑制(圖4G)，試驗(yàn)組對HBV RNA的抑制率為49.80%，而ETV組HBV RNA水平無明顯變化(圖4H)。

A：HepG2.2.15細(xì)胞；B：HepG2-NTCP細(xì)胞。

A、B：RT-PCR檢測HBV DNA和HBV RNA的表達(dá)水平；C、D：ELISA檢測細(xì)胞上清液中HBsAg and HBeAg的表達(dá)水平。

A、B：RT-PCR檢測HBV DNA和HBV RNA的表達(dá)水平；C、D：ELISA檢測細(xì)胞上清液中HBsAg and HBeAg的表達(dá)水平。

A：時間-體重曲線評估毒性作用；B、C：血清AST、ALT水平；D：RT-PCR檢測小鼠血清中HBV DNA的表達(dá)水平；E、F：ELISA檢測小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平；G、H：RT-PCR檢測小鼠肝臟組織中HBV DNA和HBV RNA的表達(dá)水平。

3 討 論

在HBV生活周期中，HBV病毒顆粒通過NTCP受體內(nèi)化入胞，脫去衣殼生成rcDNA，rcDNA進(jìn)一步被修復(fù)形成HBV復(fù)制模板即HBV的cccDNA，cccDNA轉(zhuǎn)錄生成4種不同大小的HBV RNAs，其中3.5 kb RNA可作為模板逆轉(zhuǎn)錄形成HBV DNA[13]。為開發(fā)新型的抗HBV藥物，需要選擇真實(shí)反映體內(nèi)HBV生活周期且操作簡易的HBV復(fù)制細(xì)胞模型和動物模型。本研究結(jié)果顯示，6-甲基香豆素可呈濃度依賴性的抑制HepG2.2.15細(xì)胞和HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV DNA和HBV RNA的表達(dá)水平，同時可以降低細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平。表明6-甲基香豆素在體外可顯著抑制HBV生活周期中的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程。隨后，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中對6-甲基香豆素的抗HBV效能進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，6-甲基香豆素可以顯著抑制小鼠血清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg，以及小鼠肝臟組織中HBV DNA和HBV RNA的表達(dá)水平，且呈時間依賴性。這些結(jié)果充分證實(shí)6-甲基香豆素在HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮了重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，表明6-甲基香豆素具有良好的治療HBV感染的應(yīng)用前景。

由于香豆素類化合物具有分子量小，合成簡單，生物利用度高，藥理作用廣泛，毒性小等特點(diǎn)，近年來已經(jīng)成為許多藥物研發(fā)工作的研究重點(diǎn)。有相當(dāng)數(shù)量的香豆素類化合物被報道具有抗HBV活性，且機(jī)制各不相同。扶芳藤中分離出的香豆素類化合物七葉亭，以劑量依賴的方式抑制HBx蛋白的表達(dá)，在體內(nèi)外均可有效抑制HBV復(fù)制[7]。龍須草提取物6-羥基-7-甲氧基-香豆素在無細(xì)胞毒性的條件下顯示中等抗HBV活性，降低HBsAg和HBeAg水平，但6，7二甲氧基-香豆素沒有顯示抗HBV活性。從構(gòu)效關(guān)系的角度來看，C6羥基的甲基化降低或消除了抗HBV活性，說明C6羥基在香豆素的抗HBV活性中起重要作用[14]。雙香豆素為天然香豆素的衍生物之一，具有較強(qiáng)的抗HBV效應(yīng)。雙香豆素可以降低細(xì)胞內(nèi)HBV RNA、HBV DNA，甚至能降低HBV感染細(xì)胞中cccDNA的水平，但不影響HBV的吸附/進(jìn)入[15]。目前6-甲基香豆素的研究報道較少，作用機(jī)制尚未明確。本研究顯示6-甲基香豆素在HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮了重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，且6-甲基香豆素對HBV RNA的抑制作用更為明顯。