三氯醋酸對(duì)尖銳濕疣患者的治療效果及對(duì)Foxp3、CD34水平的影響

翟偉,林文,卞坤鵬,翟翊然,田卓

1南陽(yáng)市中心醫(yī)院皮膚科(河南南陽(yáng) 473000);2上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心感染科(上海 201058)

尖銳濕疣屬于一種由乳頭瘤病毒感染所導(dǎo)致的性傳播疾病，位于肛門(mén)生殖器皮膚及皮膚黏膜處，具有復(fù)發(fā)率高、傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前臨床研究發(fā)現(xiàn)，尖銳濕疣的復(fù)發(fā)和頑固難治與患者免疫功能低下相關(guān)[1]。目前臨床上治療尖銳濕疣的方法較多，包括化學(xué)治療、冷凍療法、激光治療、電灼治療、光動(dòng)力學(xué)療法、手術(shù)治療以及免疫療法等，且臨床上對(duì)于不同種的治療方法效果評(píng)價(jià)不一[2]。三氯醋酸屬于一種化學(xué)腐蝕劑，將其涂抹于患者病變部位，通過(guò)促進(jìn)疣體蛋白萎縮而到達(dá)治療的目的，且在對(duì)患者治療過(guò)程中不會(huì)被皮膚黏膜所吸收，安全性較高[3]。在本文研究中分析三氯醋酸治療尖銳濕疣的效果，為臨床上此病的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2018年12月我院收治的100例尖銳濕疣患者，按照完全隨機(jī)法隨機(jī)分為常規(guī)治療組和三氯醋酸組各50例。常規(guī)治療組男26例，女24例，年齡25～70歲，平均(47.5±1.5)歲，病程7 d～8個(gè)月，平均(4.5±0.5)個(gè)月，皮損數(shù)目(6.2±0.3)個(gè)，皮損直徑(5.1±0.5)mm。三氯醋酸組男25例，女25例，年齡25～68歲，平均(47.2±1.4)歲，病程8 d～8個(gè)月，平均(4.2±0.4)個(gè)月，皮損數(shù)目(6.5±0.9)個(gè)，皮損直徑(5.2±0.8)mm。兩組患者在上述一般資料中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究所有患者及其家屬均知情，均簽署了知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合《尖銳濕疣診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》中對(duì)尖銳濕疣的診斷標(biāo)準(zhǔn)，疣體主要呈現(xiàn)為菜花狀、乳頭狀，且醋酸白試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)為陽(yáng)性。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患有免疫缺陷性或者自身免疫性疾病者；合并其他性病的患者；對(duì)本次研究藥物過(guò)敏者；心肺功能不全者；溝通障礙、精神障礙者；合并腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組患者均行常規(guī)激光治療，取患者膀胱截石位，行常規(guī)病變處消毒，使用2%的利多卡因局麻，采用SPLB-200A型脈沖激光治療機(jī)治療，輸出功率：0.5～30.0 W，波長(zhǎng)：10.6 μm，采用切割或者點(diǎn)灼消滅疣體，直達(dá)疣體基底部，并向外切割或者點(diǎn)灼超出疣體邊緣1～2 mm，每周1次，連續(xù)4周。常規(guī)治療組患者采用重組人干擾素α-2b治療，將其涂抹于患者病變部位及病變部位周圍，均勻涂抹，并按摩病變部位2 min，促進(jìn)藥物吸收，2～3次/d，連續(xù)4周。三氯醋酸組患者采用三氯醋酸聯(lián)合重組人干擾素α-2b治療，首先對(duì)病變處進(jìn)行常規(guī)消毒，使用醫(yī)用棉簽蘸取50%的三氯醋酸，均勻涂抹于患者病變部位，使用量以點(diǎn)遍患者病變部位為準(zhǔn)，對(duì)于病變部位較大的患者可在一處行多次點(diǎn)涂，并在此過(guò)程中避免涂及患者正常皮膚處，之后其干燥后涂抹重組人干擾素α-2b。三氯醋酸2次/d，連續(xù)治療3 d，之后觀察3 d，若仍存在疣體重復(fù)治療，重組人干擾素α-2b用法用量同常規(guī)治療組。兩組患者在治療和復(fù)查期間均禁止性生活，預(yù)防再次感染，影響效果。

1.2.2 治愈時(shí)間、疼痛評(píng)價(jià) 統(tǒng)計(jì)兩組患者徹底治愈時(shí)間，采用目測(cè)類比定級(jí)法(VAS)評(píng)價(jià)疼痛情況，患者通過(guò)畫(huà)線(10 cm的直線)來(lái)表示疼痛程度，兩端分別代表無(wú)痛、劇痛，總分為10分，畫(huà)線越長(zhǎng)說(shuō)明分?jǐn)?shù)越高表示患者疼痛感較重。

1.2.3 外周血Treg/Th17細(xì)胞平衡及Foxp3、RORγt表達(dá)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者治療前后Treg/Th17細(xì)胞平衡情況，采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3、RORγt的表達(dá)，外周血單個(gè)核細(xì)胞采用淋巴細(xì)胞分離液分離，Trizol法提取總RNA，之后對(duì)RNA純度、含量進(jìn)行檢測(cè)，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，之后使用Primer 5.0軟件對(duì)引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，使用RT-PCR方法檢測(cè)Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)量，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出需要檢測(cè)的Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)量。Foxp3引物序列：F：5′-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3′，R：5′-TCTCTCTGCCTCAGCCTTGCC-3′；RORγt引物序列：F：5′-CTGCTGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3′，R：5′-AGGAGTAGGCCGCGTTACAGC-3′；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：F：5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，R：5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

1.2.4 MCP-1、Hp、CD1a+-LC計(jì)數(shù)、CD34、VEGF表達(dá)檢測(cè) 取兩組患者治療前后疣體組織，在10%中性甲醛中固定，固定處理24 h后行常規(guī)的石蠟包埋處理，制作組織切片，厚度為4 μm。之后行常規(guī)切片脫蠟，將過(guò)氧化物酶阻斷液滴于每張切片中，在室溫下進(jìn)行孵育，孵育10 min，行組織抗原微波修復(fù)或者胰酶消化，并滴加非免疫性動(dòng)物血清，在室溫下進(jìn)行孵育，孵育5 min，滴加一抗，在濕盒中37℃進(jìn)行孵育，孵育60 min，滴加生物素所標(biāo)記的二抗，在室溫下進(jìn)行孵育，孵育10 min，滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶溶液，再次在室溫下進(jìn)行孵育，孵育10 min。上述各步驟均采用PBS反復(fù)清洗3次，食用DAB顯色，細(xì)胞核使用蘇木素復(fù)染，采用中性樹(shù)脂封片處理。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性片，陰性對(duì)照為PBS代替一抗。MCP-1、Hp表達(dá)判定：采用Motic彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析，將顯色反應(yīng)根據(jù)白-黑分為0～255個(gè)等級(jí)，1個(gè)陽(yáng)性單位(PU值)為1個(gè)等級(jí)，隨機(jī)選取每個(gè)標(biāo)本中10個(gè)視野，讀取PU值，取10個(gè)視野PU值的平均值。CD1a+-LC計(jì)數(shù)：細(xì)胞膜或者細(xì)胞核呈現(xiàn)為黃褐色樹(shù)枝狀圖突起的細(xì)胞，取5個(gè)朗格漢斯細(xì)胞分布最為密集的區(qū)域，行CD1a+-LC計(jì)數(shù)，取平均值。微血管密度計(jì)數(shù)(CD34陽(yáng)性血管計(jì)數(shù))：CD34陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核或者細(xì)胞漿出現(xiàn)棕褐色或者淡至棕黃色的顆粒，依次在低倍鏡下尋找高血管密度區(qū)，在高倍鏡下對(duì)所著色的微小血管和毛細(xì)血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算5個(gè)高倍視野下血管數(shù)量的平均數(shù)。VEGF：采用半定量積分法表示，陽(yáng)性顯色為淺黃至棕褐色顆粒，細(xì)胞質(zhì)著色占主要部分。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：不著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；著色細(xì)胞數(shù)≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。陰性(-)得分≤1分，弱陽(yáng)性(+)得分2～3分；中度陽(yáng)性(++)得分4～5分；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)得分≥6分。每份標(biāo)本在鏡頭下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，取其平均值。

1.2.5 治療效果、復(fù)發(fā)率評(píng)價(jià) 參照《尖銳濕疣診療指南(2014)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，分為痊愈、顯效、有效、無(wú)效4個(gè)評(píng)價(jià)等級(jí)。其中痊愈：疣體全部消失，無(wú)皮損；顯效：疣體全部消失，皮損面積減少60.0%～99.0%；有效:疣體全部消失，皮損面積減少20.0%～59.0%；無(wú)效：疣體未消失，皮損面積減少<19.0%。治療總有效率=痊愈率+顯效率。對(duì)患者行為期半年的隨訪，統(tǒng)計(jì)復(fù)發(fā)率，復(fù)發(fā)：患者在原皮損部位或者皮損相鄰的復(fù)位發(fā)現(xiàn)新生疣體，且醋酸白試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)為陽(yáng)性。

1.2.6 不良反應(yīng)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)輕度淺表潰瘍、紅腫疼痛、刺痛感、灼燒感等不良反應(yīng)發(fā)生情況，并作組間比較。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者徹底治愈時(shí)間、疼痛情況比較 三氯醋酸組患者徹底治愈時(shí)間、疼痛評(píng)分均低于常規(guī)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者徹底治愈時(shí)間、疼痛情況比較

2.2 兩組患者外周血Treg/Th17細(xì)胞平衡及Foxp3、RORγt表達(dá)比較 兩組患者治療前Treg、Th17、Treg/Th17、Foxp3、RORγt表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者治療后Treg、Th17、Treg/Th17、Foxp3、RORγt表達(dá)均低于治療前，且三氯醋酸組患者治療后Treg、Th17、Treg/Th17、Foxp3、RORγt表達(dá)均低于常規(guī)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者外周血Treg/Th17細(xì)胞平衡及Foxp3、RORγt表達(dá)比較

2.3 兩組患者尖銳濕疣組織中MCP-1、Hp、CD1a+-LC計(jì)數(shù)比較 兩組患者治療前MCP-1、Hp、CD1a+-LC計(jì)數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者治療后MCP-1、CD1a+-LC計(jì)數(shù)高于治療前，Hp低于治療前，且三氯醋酸組患者治療后MCP-1、CD1a+-LC計(jì)數(shù)高于常規(guī)治療組，Hp低于常規(guī)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者尖銳濕疣組織中MCP-1、Hp、CD1a+-LC計(jì)數(shù)比較

2.4 兩組患者尖銳濕疣組織中CD34、VEGF表達(dá)情況比較 兩組患者治療前CD34、VEGF表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者治療后CD34、VEGF表達(dá)均低于治療前，且三氯醋酸組患者治療后CD34、VEGF表達(dá)均低于常規(guī)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖1～2。

表4 兩組患者尖銳濕疣組織中CD34、VEGF表達(dá)情況比較

注：A：治療前；B：治療后圖1 患者治療前后CD34在尖銳濕疣組織中的表達(dá)(免疫組化，×200)

注：A：治療前；B：治療后圖2 患者治療前后VEGF在尖銳濕疣組織中的表達(dá)(免疫組化，×200)

2.5 兩組患者治療效果、復(fù)發(fā)率比較 三氯醋酸組治療總有效率高于常規(guī)治療組，復(fù)發(fā)率低于常規(guī)治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 兩組患者治療效果、復(fù)發(fā)率比較 例(%)

2.6 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 三氯醋酸組總不良反應(yīng)發(fā)生率高于常規(guī)治療組，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0.154，P=0.695)。見(jiàn)表6。

表6 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 例(%)

3 討論

尖銳濕疣屬于一種常見(jiàn)的性傳播疾病，目前臨床上認(rèn)為[4]，尖銳濕疣的主要治療原則為去除疣體并且預(yù)防復(fù)發(fā)，且常用方法包括光動(dòng)力療法、冷凍治療、微波、高頻電刀、藥物治療等。

三氯醋酸屬于一種化學(xué)腐蝕劑，會(huì)對(duì)皮膚黏膜產(chǎn)生腐蝕作用，但其對(duì)皮膚黏膜的腐蝕力較弱，可到達(dá)至上皮層[5]。有研究表明[6]，三氯醋酸可強(qiáng)效溶解角質(zhì)蛋白，目前已經(jīng)應(yīng)用于低級(jí)別陰道上皮內(nèi)瘤變的治療中，治療效果較為理想，且安全性較高。研究認(rèn)為[7]，尖銳濕疣為上皮層病變，因此臨床上認(rèn)為常規(guī)的三氯醋酸治療效果并不理想，因此在本研究中應(yīng)用50%的三氯醋酸對(duì)患者進(jìn)行治療，以增強(qiáng)其腐蝕作用，結(jié)果顯示，在患者運(yùn)用重組人干擾素α-2b治療前應(yīng)用50%的三氯醋酸，可顯著改善患者臨床癥狀，促進(jìn)恢復(fù)，此結(jié)果提示著，運(yùn)用重組人干擾素α-2b治療前應(yīng)用50%的三氯醋酸可二次殺滅患者病損處細(xì)菌，抑制病毒蔓延，降低HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)，以提高機(jī)體抗病毒能力，起到治療的目的。

尖銳濕疣患者均存在不同程度的免疫失衡，影響機(jī)體對(duì)HPV的清除，導(dǎo)致疾病反復(fù)。Treg細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞的新亞群，具有調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答、維持機(jī)體免疫自穩(wěn)等作用，在多數(shù)病毒感染性疾病中Treg細(xì)胞具有重要的平衡作用，可抑制過(guò)度免疫反應(yīng)所引起的組織損傷和保護(hù)某些病原體感染時(shí)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，影響宿主清除病原體[8]。Th17細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞的新亞群，主要分泌炎性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、自身免疫性疾病、感染性疾病中具有重要的作用[9]。Foxp3屬一種Tregs的特異性分子標(biāo)記物，在Treg細(xì)胞功能抑制和生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的意義[10-11]。RORγt屬Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，屬維甲酸相關(guān)孤兒核受體家族成員，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞生成[12-13]。本研究結(jié)果顯示，患者在患病后均存在Treg/Th17細(xì)胞失衡和Foxp3、RORγt的異常表達(dá)，治療后患者Treg/Th17細(xì)胞失衡和Foxp3、RORγt的異常表達(dá)均得到改善，但聯(lián)合應(yīng)用三氯醋酸的患者改善效果更為明顯，此結(jié)果說(shuō)明，三氯醋酸協(xié)同重組人干擾素α-2b共同發(fā)揮其藥物作用，通過(guò)改善Treg/Th17細(xì)胞失衡和Foxp3、RORγt的異常表達(dá)，改善機(jī)體細(xì)胞免疫。朗格罕斯細(xì)胞屬于皮膚與生殖器黏膜臨床上皮中的專職抗原呈遞細(xì)胞，可激發(fā)局部特異性細(xì)胞免疫和刺激T細(xì)胞，在機(jī)體免疫監(jiān)視中具有重要的作用[14]。研究認(rèn)為[15]，當(dāng)MCP-1表達(dá)降低后可抑制趨化因子所介導(dǎo)的朗格漢斯細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞前體細(xì)胞在疣體病變組織的募集，使得免疫細(xì)胞活化力下降，使得機(jī)體降低對(duì)HPV的應(yīng)答，最后引發(fā)HPV病毒免疫逃逸，導(dǎo)致疾病難愈合和易反復(fù)的發(fā)生。Hp屬急性期蛋白，可促進(jìn)血管生成、免疫調(diào)節(jié)和抗感染，研究認(rèn)為[16]，當(dāng)Hp高表達(dá)后會(huì)抑制朗格漢斯細(xì)胞免疫功能成熟。本研究顯示，治療后患者M(jìn)CP-1、Hp異常表達(dá)均得到改善，但聯(lián)合應(yīng)用三氯醋酸的患者改善效果更為明顯，此結(jié)果說(shuō)明，三氯醋酸可能通過(guò)改善MCP-1、Hp異常表達(dá)，促進(jìn)朗格漢斯細(xì)胞免疫功能成熟，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抵抗病毒。

尖銳濕疣疣體組織的生長(zhǎng)需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給和氧氣，疣體組織所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機(jī)制與促進(jìn)新生血管生成有關(guān)，且其周圍存在較多較為豐富的血流供應(yīng)，以促進(jìn)疣體生長(zhǎng)[17-18]。VEGF為血管生成因子，與血管生成相關(guān)，研究認(rèn)為[19]，尖銳濕疣患者疣體組織中VEGF表達(dá)顯著升高。目前臨床上多應(yīng)用微血管密度計(jì)數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)血管形成強(qiáng)度和能力，而CD34為一種血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，其抗原特異性較高，且其敏感性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)[20]。在本研究中運(yùn)用CD34對(duì)微血管進(jìn)行標(biāo)記，測(cè)定微血管密度計(jì)數(shù)，并檢測(cè)疣體組織中VEGF水平，結(jié)果顯示，治療后患者VEGF、CD34異常表達(dá)均得到改善，但聯(lián)合應(yīng)用三氯醋酸的患者改善效果更為明顯，此結(jié)果說(shuō)明，三氯醋酸可能通過(guò)改善VEGF、CD34異常表達(dá)，抑制疣體組織血管生成，進(jìn)而使得疣體萎縮，達(dá)到治療的目的。

本研究中將三氯醋酸應(yīng)用于尖銳濕疣的治療中，發(fā)現(xiàn)尖銳濕疣患者使用三氯醋酸治療有效，可顯著改善臨床癥狀，但因本研究樣本量較少，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)可能存在一定的偏倚，另外目前臨床上對(duì)于三氯醋酸在尖銳濕疣中研究較少，因此本研究結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)，以期望為此病的臨床治療提供新方向，促進(jìn)患者恢復(fù)。

綜上所述，尖銳濕疣患者使用三氯醋酸治療，可顯著改善機(jī)體免疫功能，維持Treg/Th17細(xì)胞平衡，改善Foxp3、CD34異常表達(dá)，改善臨床癥狀，效果顯著。