蓽茇酰胺通過誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞自噬抑制增殖

許小鴻，郅 程，袁忠民

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔科；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所，廣東廣州 510260）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的3%，口腔惡性腫瘤的90%，具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、局部轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)率及預(yù)后差等特點(diǎn)，惡性腫瘤排名第六［1-3］。雖然手術(shù)切除聯(lián)合放療、新輔助化療、靶向生物治療等在診斷和臨床治療方面取得了巨大進(jìn)展，但OSCC 患者總體生存率僅略有提高，3 年生存率為50%～75%，5 年生存率約為50%［4］。因此，尋求早期診斷和靶向治療OSCC 的新策略，成為提高此類患者預(yù)后和生存率的關(guān)鍵［5-6］。自噬是真核生物進(jìn)化上保守的能量代謝循環(huán)過程，它可以降解細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)和受損的細(xì)胞器來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、成熟分化及死亡的重要調(diào)控機(jī)制［7］。同時(shí)，自噬也是一種重要的細(xì)胞損傷機(jī)制，通過誘導(dǎo)自噬發(fā)生甚至引起自噬性死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［8］。蓽茇酰胺（piper‐longumine，PPLGM）是胡椒科植物的生物活性成分，具有抗血小板凝集、抗焦慮、抗抑郁等多種藥理學(xué)作用［9］。近年來，PPLGM 的抗腫瘤作用得到格外關(guān)注，它對(duì)前列腺癌、結(jié)腸癌、肺腺癌、肝癌和黑色素瘤等惡性腫瘤都具有顯著的抑制作用［10-13］。本文以口腔鱗狀細(xì)胞癌Cal27 及UM-1 細(xì)胞為研究對(duì)象，探究PPLGM 對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞自噬的作用及機(jī)制，為將PPLGM 作為治療口腔鱗狀細(xì)胞癌潛在藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人口腔鱗癌細(xì)胞株Cal27 及UM1 購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)于Invitrogen 公司。高糖培養(yǎng)基DMEM 購(gòu)于Invitrogen。蓽茇酰胺（PPLGM）購(gòu)自Selleck 公司。Anti-Beclin1、anti-p62、anti-LC3、an‐ti-p-mTOR、anti-mTOR、anti-p-S6 和anti-GAPDH均購(gòu)于Cell Signaling Technology。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Cal27 及UM1 細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)100 ml∕L 胎牛血清、高糖DMEM 液體培養(yǎng)液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3～5 d 用胰酶消化傳代1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 比色法檢測(cè)蓽茇酰胺對(duì)Cal27 及UM1細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，鋪96 孔板，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)懸液；體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37 ℃孵育24 h后，換含有溶劑、不同濃度PPLGM（3、6 和12 μmol∕L）的培養(yǎng)基或換含有溶劑，每組分別在培養(yǎng)24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 mg∕mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490 nm 處測(cè)量各孔的吸光值，數(shù)值控制在0.1～0.7 之間。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：將細(xì)胞等比稀釋后求出線性回歸方程，R＞0.95。根據(jù)回歸方程算出每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。相對(duì)細(xì)胞數(shù)=處理組細(xì)胞∕對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 免疫印跡法檢測(cè)蓽茇酰胺對(duì)Cal27 及UM1細(xì)胞增殖的影響 參考已發(fā)表文獻(xiàn)［6］。不同濃度PPLGM（3 及6 μmol∕L）作用Cal27 及UM-1 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，每孔PBS 2 mL 漂洗2 遍，每孔加入150 μL IP 細(xì)胞裂解液（50 mmol∕L Tris，HCl pH8.0，150 mmol∕L NaCl，1% Triton X-100，100 μg∕mL PMSF），10 min 后收集各組細(xì)胞。按照IP 裂解液法提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行BCA 法測(cè)定蛋白濃度。灌制4%集成膠和10%分離膠。200 V 電壓電泳45 min。100 V 電壓轉(zhuǎn)膜60 min。50 g∕L 脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗（Anti-Beclin1 1：1 000、an‐ti-LC3 1：1 000、anti-mTOR 1：1 000、anti-p-mTOR 1：1 000、anti-p-s6K 1：1 000 和anti-GAPDH 1：5 000）4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記抗兔或抗鼠室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光后曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以（）表示，多樣本間比較采用單因素方差分析one-way ANOVA，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蓽茇酰胺對(duì)Cal27及UM1細(xì)胞株增殖的影響

2.1.1 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)Cal27 及UM1 細(xì)胞株增殖的影響 不同濃度（0.5、1.0、2.0、3.0 和5.0 μmol∕L）處理Cal27 及UM1 細(xì)胞72 h，然后MTT 比色分析法測(cè)定統(tǒng)計(jì)相對(duì)細(xì)胞數(shù)。隨著PPLGM 濃度增加，Cal27 及UM1 細(xì)胞數(shù)逐漸減少，呈濃度依賴關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Cal27：F=196.859，P=0.000，UM1：F=314.018，P=0.000；圖1）。采 用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)Cal27 細(xì)胞藥物濃度為0.5 μmol∕L 組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而UM1 細(xì)胞組間兩兩比較，除藥物濃度為0.5 μmol∕L 組與對(duì)照組及藥物濃度為0.5 μmol∕L 組與1.0 μmol∕L 比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 蓽茇酰胺抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖Fig.1 PPLGM suppresses the proliferation of oral squa?mous cell carcinoma cells

2.1.2 不同作用時(shí)間蓽茇酰胺對(duì)Cal27 及UM1 細(xì)胞株增殖的影響 同對(duì)照比，3.0 μmol∕L PPLGM 使細(xì)胞數(shù)減少約50%。采用3.0 μmol∕L PPLGM 處理細(xì)胞，24 h 后細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組，隨著處理時(shí)間增加，細(xì)胞數(shù)越來越少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Cal27：F=187.723，P=0.000；UM1：F=113.237，P=0.000）。采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較，Cal27 各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；UM1細(xì)胞組間兩兩比較，除作用時(shí)間為12 h組與各組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，PPLGM能抑制口腔癌Cal27及UM1細(xì)胞的增殖活力。

2.2 蓽茇酰胺誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生自噬

不同濃度PPLGM（1.0、3.0 和5.0 μmol∕L）處理Cal27 和UM1 細(xì)胞24 h 后收集蛋白。與對(duì)照組相比，PPLGM 處理使LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表達(dá)增加，而Beclin-1 和p62 蛋白降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 蓽茇酰胺促進(jìn)Cal27 和UM1自噬Fig.2 PPLGM promotes autophagy in Cal27 and UM1

PPLGM 處理Cal27 細(xì)胞株LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1 和p62 統(tǒng) 計(jì) 結(jié)果 分 別 為：F=114.949，P=0.000。除1.0 μmol∕L 組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLC3-Ⅰ＞0.05），余組間兩兩比較均PLC3-Ⅰ＜0.05。除1.0μmol∕L組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLC3-Ⅱ＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLC3-Ⅱ＜0.05）。除藥物濃度為1.0 μmol∕L 組與對(duì)照及3.0 μmol∕L 組與5.0 μmol∕L 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（PBeclin-1＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PBeclin-1＜0.05）。藥物濃度5.0 μmol∕L 組與對(duì)照組與5.0 μmol∕L 組與1.0 μmol∕L 組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp62＜0.05），其余組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp62＞0.05）。

PPLGM 處理UM1 細(xì)胞株LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Be‐clin-1 和p62 統(tǒng)計(jì)結(jié)果：F=21.111，P=0.000。藥物濃度5.0μmol∕L組與對(duì)照組、1.0μmol∕L 及3.0 μmol∕L 比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLC3-Ⅰ＜0.05）；其余組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLC3-Ⅰ＞0.05）。除藥物濃度為1.0 μmol∕L組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（PLC3-Ⅱ＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLC3-Ⅱ＜0.05）。1.0 μmol∕L 組和5.0 μmol∕L 組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PBeclin-1＜0.05），其余組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PBeclin-1＞0.05）。除藥物濃度為1.0 μmol∕L 組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（Pp62＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp62＜0.05）。

2.3 蓽茇酰胺通過抑制mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬

為了探討PPLGM 引起自噬的機(jī)制，我們首先檢測(cè)PPLGM 是否通過影響mTOR 信號(hào)通路活性，該信號(hào)通路活性改變與細(xì)胞自噬發(fā)生密切相關(guān)。將不同濃度PPLGM（1.0、3.0 和5.0 μmol∕L）處理兩株細(xì)胞24 h 后收集蛋白，進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。如圖3 結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，PPLGM 處理未使mTOR 總蛋白發(fā)生明顯變化（Cal27：FmTOR=2.672，PmTOR=0.118。UM-1：FmTOR=1.769，PmTOR=0.231），但p-mTOR磷酸化水平顯著下降，其下游底物p-S6也隨之而降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 蓽茇酰胺抑制p-mTOR及p-S6磷酸化Fig.3 PPLGM treatment causes a decrease of p-mTOR and p-S6

不同濃度PPLGM（1.0、3.0 和5.0 μmol∕L）處理Cal27 后p-mTOR 水平比較，F(xiàn)=6.114，P=0.018。對(duì)照組、藥物濃度為1.0 μmol∕L 組分別與3.0 μmol∕L組及5.0μmol∕L組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp-mTOR＜0.05），余組間兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp-mTOR＞0.05）。除藥物濃度為1.0 μmol∕L 組與對(duì)照組及3.0 μmol∕L組與5.0μmol∕L組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（Pp-S6K＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp-S6K＜0.05）。

不同濃度PPLGM（1.0、3.0 和5.0 μmol∕L）處理UM1 后，F(xiàn)=60.523，P=0.000。除藥物濃度為1.0 μmol∕L 組與對(duì)照組及3.0 μmol∕L 組與5.0 μmol∕L 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（Pp-mTOR＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp-mTOR＜0.05）。藥物濃度為1.0 μmol∕L 和3.0 μmol∕L 組與對(duì)照組及1.0 μmol∕L 組與3.0 μmol∕L 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（Pp-S6K＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pp-S6K＜0.05）。這些結(jié)果表明PPLGM 通過下調(diào)mTOR∕S6通路活性引起Cal27和UM-1細(xì)胞發(fā)生自噬。

2.4 自噬抑制劑3-MA或BAFA1阻斷蓽茇酰胺誘導(dǎo)的自噬信號(hào)通路

細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在胞漿里形成自噬體（autophagosome），這個(gè)過程中LC3-Ⅱ的生成是關(guān)鍵標(biāo)志。自噬體形成后，可與溶酶體融合，自噬體中的內(nèi)容物隨即被降解，產(chǎn)物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中，這個(gè)階段p62 的降解是標(biāo)志性事件之一。這兩個(gè)過程統(tǒng)稱為自噬流。于是，我們分別用自噬流兩個(gè)階段的抑制劑3-MA（抑制LC3-Ⅱ生成）或BAFA1（抑制p62 降解），檢測(cè)能否阻斷PPLGM 引起的自噬流。見圖4 所示，3-MA 和PPLGM 共處理細(xì)胞24 h，會(huì)顯著抑制LC3-Ⅱ表達(dá)和p62的降解。

圖4 3-MA或BAFA1可抑制蓽茇酰胺引起的自噬Fig.4 The inhibitor 3-MA or BAFA1 rescues PPLGM-induced autophagy

3-MA和PPLGM共處理Cal27細(xì)胞（P=0.001；P=0.000）。3-MA 和PPLGM 共處理UM1 細(xì)胞（P=0.885；P=0.001），而BAFA1 僅能抑制p62 的降解（P=0.000；P=0.000）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明PPLGM可引起Cal27和UM-1細(xì)胞發(fā)生完整的自噬流。

2.5 自噬抑制劑3-MA或BAFA1可阻斷蓽茇酰胺的抑制增殖效應(yīng)

為了證明PPLGM 引起的自噬是否導(dǎo)致增殖抑制，我們將3-MA 或BAFA1 和PPLGM 共處理細(xì)胞72 h，用MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。圖5 結(jié)果顯示，與單獨(dú)PPLGM 處理比較，3-MA 或BAFA1 會(huì)顯著恢復(fù)PPLGM 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。Cal27 細(xì)胞：F=157.446，P=0.000。除 PPLGM+BAFA 組與PPLGM+3-MA 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（PCal＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PCal＜0.05）。Um1 細(xì)胞：F=133.649，P=0.000。除PPLGM+BAFA 組與PPLGM+3-MA 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（PUm1＞0.05），余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PUM1＜0.05）。這些結(jié)果表明PPLGM 通過引起自噬抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖5 3MA或BAFA1可拮抗蓽茇酰胺對(duì)增殖的抑制效應(yīng)Fig.5 3MA or BAFA1 rescues PPLGM-caused inhibi?tion on proliferation

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌作為危害人類健康和生命常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和精神狀態(tài)［14］。隨著治療OSCC 的不斷發(fā)展，相關(guān)治療手段已不僅局限在手術(shù)治療，還可以結(jié)合化療、放療等其他治療方式［1，4］。因此，尋找更有效但毒性較小的新型抗腫瘤制劑逐漸成為研究熱點(diǎn)。

作為抗腫瘤藥物的有效來源，天然藥物在腫瘤的治療中發(fā)揮了重要作用。PPLGM 屬生物堿類化合物，具有廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷力且對(duì)正常細(xì)胞、組織、器官無明顯毒副作用［3，15］，但PPLGM 是否能抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖及相關(guān)機(jī)制尚未見報(bào)道。本課題組研究了PPLGM 抑制口腔鱗癌細(xì)胞株Cal27 和UM1 細(xì)胞增殖的作用。MTT 分析法結(jié)果顯示，PPLGM 明顯抑制Cal27 和UM1 細(xì)胞的增殖，并隨著濃度和時(shí)間的增加而增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PPLGM 通過抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌自噬導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力減弱。據(jù)我們所知，這是首次驗(yàn)證PPLGM 對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

自噬是一種保守的細(xì)胞內(nèi)降解通路，通過形成自噬體并與溶酶體融合，從而將細(xì)胞內(nèi)大分子及細(xì)胞器進(jìn)行降解，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［16］。自噬是一把雙刃劍，根據(jù)細(xì)胞環(huán)境和功能狀態(tài)的不同，可提高細(xì)胞活力，或誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡［17］。自噬活化時(shí)，LC3-I 酯化形成LC3-Ⅱ型蛋白，并定位于自噬泡，因此其水平在一定程度上反映了自噬體的數(shù)量和自噬的程度，也常作為自噬發(fā)生的一個(gè)指標(biāo)［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPLGM 可明顯增加Cal27和UM1細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量，而3-MA 和BAFA1 能阻斷的PPLGM 引起的自噬效應(yīng)和抑制增殖效應(yīng)。以上結(jié)果提示，PPLGM 誘導(dǎo)Cal27和UM1細(xì)胞發(fā)生自噬是其發(fā)揮抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制之一。

PI3K∕mTOR 信號(hào)通路是調(diào)控自噬的經(jīng)典通路之一。mTOR 活性抑制可誘導(dǎo)ULK1 蛋白磷酸化，促進(jìn)LC3、Beclin1 等自噬蛋白的招募，誘導(dǎo)自噬的發(fā) 生［13，18-19］。磷酸化S6核糖體蛋白（p-S6）是mTOR 信號(hào)通路下游執(zhí)行功能的關(guān)鍵靶蛋白，當(dāng)mTOR 信號(hào)通路異常激活時(shí)，下游通路將接收持續(xù)的刺激信號(hào)，異常激活靶蛋白p-S6，影響下游效應(yīng)分子的改變，引起細(xì)胞持續(xù)增殖，導(dǎo)致腫瘤形成［20-21］。本文研究發(fā)現(xiàn)，PPLGM能顯著降低pmTOR及p-S6K磷酸化水平，表明PPLGM通過調(diào)控mTOR信號(hào)通路調(diào)控Cal27和UM1細(xì)胞自噬。

綜上所述，PPLGM 能抑制口腔癌Cal27 和UM1細(xì)胞增殖；同時(shí)，升高LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平及降低p-mTOR 和p-s6 表達(dá)水平，誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞自噬，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降。本文研究為將PPLGM 用于治療口腔鱗狀細(xì)胞癌提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。