CFTR通過(guò)調(diào)控二磷酸腺苷受體P2Y12影響血小板活化

李 俊，楊涵滟，韓 慧，李 梅，王冠蕾

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室和心腦血管研究中心，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院特診醫(yī)療病區(qū)，廣東廣州 510630）

血小板的主要生理功能是止血，當(dāng)血管內(nèi)發(fā)生出血事件或者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂時(shí)，血小板活化分泌致密顆粒促進(jìn)血小板自身活化、單核細(xì)胞-血小板以及中性粒細(xì)胞-血小板聚集，纖維蛋白原暴露，血小板膜上糖蛋白Ⅵ（glycoprotein Ⅵ）與纖維蛋白結(jié)合從而引發(fā)血栓形成［1］。血小板的異常激活是血栓相關(guān)疾病如心肌梗塞的主要病理機(jī)制。二磷酸腺苷（ADP）受體P2Y12介導(dǎo)的血小板活化信號(hào)通路是血小板活化的核心機(jī)制，如目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗血小板藥物之一就是P2Y12受體抑制劑。P2Y12是一種G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-cou‐pled receptors GPCRs），ADP 與其細(xì)胞外部分結(jié)合能激活P2Y12［2-6］。除了與ADP結(jié)合外，P2Y12激活還能促進(jìn)整合素αⅡbβ3 活化，進(jìn)一步放大凝血酶、血栓素A2 介導(dǎo)的血小板活化信號(hào)。P2Y12激活后通過(guò)PI3K-AKT 信號(hào)通路促進(jìn)血小板聚集，促進(jìn)血小板介導(dǎo)血栓的形成；同時(shí)這條信號(hào)通路還能促進(jìn)致密顆粒釋放多種血小板活性物質(zhì)，對(duì)血小板介導(dǎo)的血栓形成發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。囊性纖維化跨膜電導(dǎo) 調(diào) 節(jié) 子（cystic fibrosis transmembrane conduc‐tance regulator，CFTR）在1989 年首次由Riordan 克?。?］，CFTR基因編碼一種cAMP 激活的氯離子通道。CFTR單基因突變可引起一種人類遺傳疾病囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）。其中最常見的基因突變是CFTR外顯子上3 個(gè)堿基對(duì)的缺失，可引起CFTR 蛋白第508 位置上的苯丙氨酸殘基缺失（ΔF508）［8］。CF 病人由于CFTR 編碼的氯離子通道功能障礙，引起呼吸道及腸道黏膜等腺上皮器官分泌異常，黏膜增厚及黏液粘稠，導(dǎo)致呼吸困難、反復(fù)感染等癥狀［9-10］。以往研究提示CF 病人外周血小板活性增高［10］，最近有報(bào)道應(yīng)用巨核細(xì)胞∕血小板特異性敲除CFTR小鼠證實(shí)了CFTR敲除可促進(jìn)血小板介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［11］，促進(jìn)血小板和淋巴細(xì)胞相互作用。但是，CFTR 和血小板活化的相關(guān)性及具體分子機(jī)制仍未完全清楚。由于P2Y12激活在血小板活化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，本研究還揭示了CFTR可能通過(guò)調(diào)控P2Y12蛋白表達(dá)從而影響血小板活化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)為：SYSU-IA‐CUC-2020-000446，并且符合國(guó)家科技部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。CFTR基因敲除小鼠［CFTRtm1UncTg（FABPCFTR）1Jaw∕J；Cftr-∕-］購(gòu)于美國(guó)The Jackson Laboratory，該小鼠是C57BL∕6、FVB∕N和129的混合遺傳背景。文中所涉及的C57BL∕6小鼠全部購(gòu)置于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK（粵）2018-0003。P2Y12全基因敲除（P2Y12

-∕-）小鼠購(gòu)于美國(guó)Shering Plough 公司，該小鼠的遺傳背景為C57BL∕6。本研究中所有小鼠均為8～16 周齡，性別體質(zhì)量匹配。所有小鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為：SPF 級(jí)動(dòng)物房，每籠5 只小鼠，每日清掃，專人喂養(yǎng)。室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，模擬正常晝夜生物節(jié)律。

1.2 主要材料

人巨核細(xì)胞株（Megakaryocyte cell strains；Meg-01）細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)American type culture collec‐tion（ATCC），RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，CFTR抗體購(gòu)于美國(guó)Novus公司，P2Y12抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司，PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technolo‐gy 公司，β-actin 抗體和α-tublin 抗體購(gòu)于中國(guó)Boster 生 物 公 司，CFTRinh-172（CFTR inhibitor）、ADP、膠原蛋白、腎上腺素購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，BCA 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，ECL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio Tek 公司；高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf Centrifuge 公司；電轉(zhuǎn)裝置：美國(guó)Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)ChemiDoc XRS 公司；石蠟切片機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientif‐ic公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠外周血血小板提取 分別取8～16 周的Cftr-∕-鼠和C57BL∕6（Cftr+∕+）鼠，用10 g∕L 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠。打開小鼠腹腔，棉簽分離出小鼠腹主動(dòng)脈，使用2 mL 注射器進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，全血轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中。在25℃，300×g條件下離心2 min，得到上層富含血小板血清。將上層血清在25 ℃，500×g條件下再次離心5 min，棄去上清得到血小板沉淀，留下備用。

1.4.2 肺栓塞模型構(gòu)建和HE 染色 分別取8～16周Cftr-∕-鼠和Cftr+∕+鼠兩組（n=6）。用0.8 mg∕kg 膠原蛋白和60 μg∕kg 腎上腺素注射入下腔股靜脈，30 min 后仍存活小鼠為肺栓塞模型建模成功。處死后取出肺組織，PBS 沖洗后置于40 g∕L 多聚甲醛中固定過(guò)夜。從固定液中取出肺組織，用0.1 mol∕L PBS 溶液洗3次，然后將肺組織依次放入5%、10%、15%的蔗糖梯度溶液中脫水30 min，最后將其放入20%的蔗糖溶液中4 ℃脫水過(guò)夜。將組織取出用濾紙吸干后，用OTC 包埋劑包埋，制備肺臟組織冰凍切片，切片做Hematoxylin-eosin（H&E）染色，顯微鏡下觀察血栓水平。

1.4.3 ADP刺激Meg-01細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 用含有100 mL∕L FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)Meg-01 細(xì)胞，待細(xì)胞密度至5×105∕mL 時(shí)，分別孵育不同濃度的ADP（0、0.3、1、5和10 μmol∕L），孵育后提取細(xì)胞蛋白。

1.4.4 免疫印跡法 將細(xì)胞或者提取的血小板加入RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑（cocktail）冰上裂解20 min。在4 ℃，15 000×g條件下離心15 min，得到蛋白上清液。用BCA 試劑盒蛋白定量后，按每孔30 μg 蛋白上樣。用Bio-Rad 儀器進(jìn)行SDSPAGE 電泳2 h，轉(zhuǎn)膜。室溫封閉90 min 后，與相應(yīng)一抗抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜后，用二抗室溫孵育90 min，ECL 反應(yīng)顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-rad）下顯影。使用Image J 1.42 軟件，根據(jù)條帶灰度值，對(duì)目的蛋白表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析［12］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)處理兩樣本間比較采用Student’st檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，對(duì)于不同濃度處理組檢測(cè)結(jié)果和對(duì)照組比較采用Dunnett’st檢驗(yàn)；所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism version 8.20 軟件統(tǒng)計(jì)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFTR 基因敲除促進(jìn)膠原蛋白/腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈血栓形成

以膠原蛋白（0.8 mg∕kg）∕腎上腺素（60 μg∕kg）注射入Cftr-/-和同周齡Cftr+/+的小鼠下腔股靜脈，以誘導(dǎo)小鼠肺動(dòng)脈血栓形成。注射30 min 后處死小鼠，取肺組織切片行HE染色。如圖1所示，Cftr-/-小鼠的肺動(dòng)脈血栓栓塞數(shù)量明顯大于Cftr+/+小鼠（n=6）。

圖1 CFTR 基因敲除增加肺動(dòng)脈血栓血栓栓塞數(shù)目Fig.1 CFTR knockout increased thrombus formation in the pulmonary artery thrombosis model

2.2 CFTR基因敲除上調(diào)小鼠外周血血小板P2Y12及其介導(dǎo)的血小板活化信號(hào)通路

分離8 周齡Cftr-/-及Cftr+/+小鼠外周循環(huán)血液的血小板，Cftr-/-小鼠血小板P2Y12蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；圖2A）；Cftr-/-小鼠血小板PI3K 和AKT 蛋白磷酸化水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01；圖2B）；與Cftr+/+組相比，Cftr-/-小鼠血小板PI3K 和AKT 總蛋白水平無(wú)顯著差異。

2.3 P2Y12 基因敲除小鼠外周循環(huán)血小板CFTR蛋白表達(dá)無(wú)改變

如圖3 所示，P2Y12-/-小鼠外周血小板上CFTR蛋白表達(dá)與WT 小鼠相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 P2Y12基因敲除不影響小鼠外周血小板CFTR蛋白表達(dá)Fig.3 P2Y12 KO has no influence on CFTR protein expression in mouse circulating platelets

2.4 ADP刺激Meg-01細(xì)胞后CFTR 和P2Y12 蛋白表達(dá)變化

如圖4 所示，用不同濃度ADP（0、0.3、1、5 和10 μmol∕L）刺激人巨核細(xì)胞株Meg-01 細(xì)胞，顯示P2Y12蛋白表達(dá)逐漸增加，5 μmol∕L ADP 刺激時(shí)，P2Y12蛋白表達(dá)即顯著增加（5 μmol∕L：1.2±0.3vs.0 μmol∕L：0.4±0.1，q=4.684，P=0.003 4），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CFTR 蛋白表達(dá)則隨著ADP 刺激濃度增加而逐漸下降（F=22.51，P＜0.000 1），與對(duì)照組相比，1 μmol∕L ADP 刺激時(shí)CFTR 表達(dá)即顯著下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1 μmol∕L：0.7±0.1vs.0 μmol∕L：1.1±0.1，q=6.214，P=0.000 4）。ADP刺激活化P2Y12后，其下游PI3K 以及AKT 蛋白磷酸化表達(dá)也顯著增強(qiáng)，而總蛋白并沒(méi)有改變。另外，ADP 在1～10 μmol∕L 濃度范圍與MEG-01 細(xì)胞共孵育12 h 未觀察到其對(duì)于細(xì)胞增殖有影響（結(jié)果未顯示）。

圖4 ADP刺激Meg-01細(xì)胞對(duì)CFTR和P2Y12蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effects of ADP on the protein expression of CFTR and P2Y12 in Meg-01 cells

2.5 CFTRinh-172誘導(dǎo)Meg-01細(xì)胞P2Y12蛋白表達(dá)

如圖5 所示，不同濃度的CFTRihn-172（0、1.25、2.5、5 和10 μmol∕L）與Meg-01 細(xì)胞共孵育24 h，發(fā)現(xiàn)CFTRinh-172 不影響CFTR 蛋白表達(dá)，而P2Y12蛋白表達(dá)則隨著CFTRinh-172 刺激濃度增加而逐漸升高（方差分析統(tǒng)計(jì)量F=12.59，P＜0.000 1），與未加CFTRinh-172 組相比，5 μmol∕L 的CFTRinh-172 引起P2Y12蛋白表達(dá)顯著增加（5 μmol∕L：0.9±0.3vs.0 μmol∕L：0.4±0.1，q=4.7，P=0.000 5）。

圖5 CFTRinh-172誘導(dǎo)Meg-01細(xì)胞P2Y12蛋白表達(dá)升高Fig.5 CFTRinh-172 induced an increase of P2Y12 protein expression in Meg-01 cells

3 討論

本文主要發(fā)現(xiàn)了阻斷CFTR 氯通道或是降低CFTR 蛋白表達(dá)均能夠通過(guò)誘導(dǎo)循環(huán)血液血小板P2Y12表達(dá)的升高，從而影響血小板活化。同時(shí)，應(yīng)用Cftr-/-小鼠肺栓塞顯著加重，提示CFTR 可能參與病理情況下由血小板活化所引起的后續(xù)事件如血栓和炎癥等。

血小板活化無(wú)論是在動(dòng)脈和靜脈血栓形成過(guò)程中，均占據(jù)核心地位［1］。早期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CF病人的血小板高反應(yīng)活性，包括血小板-淋巴細(xì)胞微顆粒增加［10，13-14］；感染綠膿桿菌的CF患者血小板產(chǎn)生的炎癥因子sCD40L 顯著增加［15-16］。這些研究提示CFTR 氯通道功能降低促進(jìn)血小板活化。但CFTR調(diào)控血小板活化的機(jī)制并不清楚。我們應(yīng)用特異性通道組阻斷劑CFTRinh-172 以阻斷Meg-01細(xì)胞上的跨膜Cl-外流，模擬了CFTR 氯通道功能降低，發(fā)現(xiàn)CFTRinh-172 可濃度依賴性誘導(dǎo)P2Y12表達(dá)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在Cftr-/-小鼠靜息情況下血小板上的P2Y12蛋白表達(dá)和PI3K-AKT 磷酸化水平都顯著升高，PI3K-AKT磷酸化是P2Y12下游經(jīng)典的血小板聚集信號(hào)分子［17-18］，上述發(fā)現(xiàn)提示CFTR基因敲除不但通過(guò)上調(diào)P2Y12促進(jìn)血小板活化，也可能影響血小板活化的后續(xù)事件，如血栓形成、血管炎癥等。但值得注意的是，由于CFTR氯通道基因在多種組織和細(xì)胞上廣泛分布，CFTR 是否能調(diào)控血小板聚集和血栓形成應(yīng)該在血小板特異性敲除CFTR小鼠上進(jìn)行驗(yàn)證。

ADP 是體內(nèi)最重要的引起血小板聚集的物質(zhì)［17，20-21］，我們采用體外ADP 刺激Meg-01 細(xì)胞以模擬在體的血小板活化狀態(tài)，由于血小板是由骨髓巨核細(xì)胞或者肺的巨核細(xì)胞分化產(chǎn)生的無(wú)核血細(xì)胞。血小板在體內(nèi)存活時(shí)間約7～14 d，在體外無(wú)法培養(yǎng)。人成巨核細(xì)胞白血?。∕eg-01）細(xì)胞已公認(rèn)為一種研究血小板電生理特性或者長(zhǎng)時(shí)程功能蛋白或基因表達(dá)的替代細(xì)胞株，因?yàn)椋孩倬藓思?xì)胞是最直接的血小板前體，它們?cè)诠δ苄苑肿颖磉_(dá)和特性上有很多的相似之處。②由于巨核細(xì)胞較大的尺寸、特殊的形態(tài)以及結(jié)合到巨核細(xì)胞∕血小板特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物CD41的能力。我們發(fā)現(xiàn)ADP誘導(dǎo)P2Y12及其下游PI3K-AKT 上調(diào)的同時(shí)，CFTR蛋白表達(dá)顯著下降，這與Cftr-/-小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。另外，P2Y12的激活還能放大其他血小板活性物質(zhì)如凝血酶介導(dǎo)的血小板分泌活動(dòng)，并通過(guò)放大磷脂酰絲氨酸的膜上暴露，血小板衍生的微粒形成和膠原誘導(dǎo)的組織因子（TF）暴露來(lái)促進(jìn)血栓形成、血管炎癥反應(yīng)［5-6］。是否CFTR 可能通過(guò)調(diào)控P2Y12，繼而影響血小板其他功能，也需要進(jìn)一步研究。另外，我們?cè)赑2Y12-/-小鼠血小板上發(fā)現(xiàn)CFTR 蛋白表達(dá)和WT 鼠相比無(wú)明顯變化，這提示CFTR位于P2Y12活化信號(hào)通路的上游，但中間通過(guò)哪些信號(hào)分子介導(dǎo)，現(xiàn)在還不清楚。

綜上所述，我們揭示了CFTR 調(diào)控血小板活化的一個(gè)新機(jī)制：阻斷CFTR 氯通道或是降低CFTR蛋白表達(dá)可上調(diào)血小板P2Y12表達(dá)從而增強(qiáng)血小板活化，并上調(diào)P2Y12下游血小板聚集信號(hào)分子如PI3K-AKT。