糖尿病合并膿毒癥小鼠腸損傷特點

龐昌季，譚 芳，鄭 磊，曹鈺玲，鄧穎青，池信錦

（中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院麻醉科，廣東深圳 518107）

糖尿病的檢出率及患病率逐年上升［1-2］，已成為威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生難題，在中國這一情況更為嚴(yán)重［3-4］。膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是重癥病房中非心臟病人死亡的首要病因，病死率高達(dá)17%～26%［5］。糖尿病并發(fā)膿毒癥的風(fēng)險是非糖尿病患者的2.5～6.0 倍［6］。糖尿病可加重膿毒癥時心腦血管、呼吸、泌尿等全身重要器官功能障礙，但其具體損傷機制尚未明確［7-9］。腸道損傷是膿毒癥發(fā)展為多器官功能障礙（MODS）的始動環(huán)節(jié)，腸道中腸黏膜屏障功能的存在保障了機體在腸道內(nèi)寄居多種細(xì)菌下不會被感染［10-11］。腸內(nèi)巨噬細(xì)胞在腸黏膜屏障中識別內(nèi)毒素，吞噬病原體，并進(jìn)一步激活下游免疫功能。激活的M1 型巨噬細(xì)胞可分泌IL6、IL8、TNF 等促炎因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫監(jiān)視作用，但是釋放一氧化氮（NO）、超氧和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等可誘導(dǎo)組織損傷。巨噬細(xì)胞極化在炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用［12-13］。Liu 等［14］研究證實促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 轉(zhuǎn)化，M1∕M2 比例增高加重腸缺血再灌注損傷，而逆轉(zhuǎn)這一變化，則具有顯著的防治效果。然而，糖尿病合并膿毒癥時腸損傷情況及巨噬細(xì)胞極化特點目前相關(guān)研究較少。本研究擬通過構(gòu)建糖尿病膿毒癥小鼠模型，觀察糖尿病合并膿毒癥時腸損傷特點，并結(jié)合體外細(xì)胞實驗，初步探討巨噬細(xì)胞極化在其中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級BKS-DB（Lepr wt/wt）野生型小鼠12 只，體質(zhì)量20～25g；SPF 級BKS-DB（Lepr ko/ko）糖尿病小鼠12只，體質(zhì)量40～45 g，均為雄性，6～8 周齡，由廣東省藥康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（粵）20200054。實驗動物飼養(yǎng)于SPF 屏障環(huán)境：動物房環(huán)境在（23±2）℃，相對濕度在（55±5）%，及12 h 光∕暗循環(huán)，水和食物獲取自由。實驗動物的管理及處置遵循廣東省動物管理委員會準(zhǔn)則及動物福利準(zhǔn)則。

1.1.2 實驗試劑 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（Sigma，L4524）；DMEM 培養(yǎng)基（凱基）；West‐ern Blot 抗 體Occludin（abcam）、ZO-1（abclonal）、GAPDH（abclonal）；免疫熒光抗體F4∕80（賽維爾）；RNA 提取試劑Trizol（Invitrogen）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 和SYBR?Green Real-time PCR Master Mix（TOYOBO）；qPCR 引物序列（廣州復(fù)能生物技術(shù)有限公司）；CD86 流式抗體（Biolegend）；CD163 流式抗體（Biolegend）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠膿毒癥模型的建立 小鼠隨機分成4組（n=6）：非糖尿病假手術(shù)組（NDMS）、非糖尿病膿毒癥模型組（NDMCLP）、糖尿病假手術(shù)組（DMS）、糖尿病膿毒癥模型組（DMCLP）。模型組采用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）建立膿毒癥模型。雄性小鼠，常規(guī)禁食8 h后，腹腔注射100 g∕L 水合氯醛0.3 mL∕kg麻醉小鼠。在腹部正中間沿腹白線做一個長1 cm的切口。取出盲腸，將盲腸全長分為3等分，用4-0尼龍縫線結(jié)扎其近回盲瓣端1∕3 處，在結(jié)扎處與盲腸盲端之間中點處用22G 無菌注射器針頭從系膜緣向?qū)ο的ぞ壺炌ù┐蹋缓筝p輕擠壓穿刺點附近盲腸并擠出少許腸內(nèi)容物，將盲腸連同擠出的內(nèi)容物一同還納入腹腔，逐層縫合并關(guān)閉腹腔。術(shù)后給予4 mL∕100g生理鹽水皮下注射進(jìn)行液體復(fù)蘇。假手術(shù)組的動物不進(jìn)行盲腸的結(jié)扎和穿孔，其余的處理與模型組相同。手術(shù)過程盡量避免動物體液的大量丟失，并注意實驗動物體溫的維持。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 采用小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞株（中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號SCSP-538）培養(yǎng)條件：100 ml∕L FBS 的DMEM 培養(yǎng)基加1% PSG 雙抗，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以5×104∕mL 的密度鋪板于6 孔板，利用35 mmol∕L 高糖和LPS 1 μg∕mL 共同刺激24 h 后收集細(xì)胞，分別用于流式細(xì)胞和RT-qPCR檢測。

1.2.3 病理學(xué)檢測 取小腸組織用40 g∕L 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作3～4 μm 蠟切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理改變。每張片隨機選取10個視野，按照Chiu's評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）取小鼠小腸組織，稱質(zhì)量后加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液（RI‐PA：PMSF 100：1），冰上碾磨組織，4 ℃條件下12 000×g離心20 min，收集上清，采用BCA 法測定蛋白濃度。取25 μg 蛋白進(jìn)行SDS‐PAGE 電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Occludin、ZO-1 抗體，4 ℃孵育過夜。次日，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL 試劑曝光顯影，在全自動凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.2.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）應(yīng)用Trizol提取組織和細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green法進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)，以上步驟按照說明書操作。TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、CRR7、Arg1、Fizz1 引物由廣州復(fù)能提供驗證后引物。

1.2.6 免疫熒光染色 組織石蠟切片常規(guī)固定、脫蠟、高壓修復(fù)和封閉。封閉后加入一抗：兔多克隆抗體（1：1 000，F(xiàn)4∕80，賽維爾），4 ℃濕盒孵育過夜后，PBS 清洗一抗，敷相應(yīng)已稀釋的FITC 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶200；激發(fā)波長：492 nm，發(fā)射波長：520 nm）中，室溫避光孵育1 h，PBS 清洗二抗。晾干后于熒光顯微鏡（EVOS FL，Life Technologies，Carlsbad，CA）下觀察并拍照。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) 經(jīng)高糖和LPS 處理后的細(xì)胞用PBS 清洗3 次，離心收集細(xì)胞。然后細(xì)胞4 ℃CD86 和CD163流式抗體（Biolegend）共孵育30 min，流式細(xì)胞緩沖液清洗細(xì)胞3 次，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD86 和CD163 表達(dá)，最后使用軟件FlowJo 分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)注差（xˉ+s）表示，多組間比較采用單因素方差分析ANOVA 分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗行組間兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05（雙尾），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸組織病理學(xué)改變及評分

HE 染色顯示NDMS 組小鼠腸黏膜完整，絨毛排列整齊；DMS組小腸粘膜增厚，絨毛輕度水腫，絨毛頂端上皮下間隙增大；NDMCLP 組小鼠腸黏膜失去完整性，絨毛脫落，炎性細(xì)胞浸潤；DMCLP 組腸黏膜破壞嚴(yán)重，絨毛上皮成塊脫落，炎性細(xì)胞浸潤，絨毛固有層間隙擴大，充血明顯。Chiu’s 評分顯示，糖尿病鼠膿毒癥模型組腸黏膜損傷程度比非糖尿病鼠模型組更嚴(yán)重；各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.94，P=0.000；圖1）。

圖1 四組小鼠腸組織病理評分的比較Fig.1 Intestinal pathological changes and Chiu’s scores

2.2 Western Blot檢測腸組織Occludin、ZO-1表達(dá)

為了觀察腸道屏障功能改變，我們采用West‐ern Blot 檢測腸屏障功能核心蛋白Occludin、ZO-1的表達(dá)，結(jié)果顯示，糖尿病小鼠腸組織Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)降低（NDMS 組和DMS 組）；與非糖尿病模型組相比，糖尿病模型組Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)顯著降低。各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Occludin：F=178.5，P=0.000；ZO-1：F=16.55，P=0.001；圖2）。

2.3 腸巨噬細(xì)胞極化情況

為了觀察巨噬細(xì)胞數(shù)量與分布，我們采用免疫熒光的方法檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)記F4∕80 的表達(dá)，結(jié)果顯示DMCLP 組腸組織中巨噬細(xì)胞明顯增加（圖3 A）。為了進(jìn)一步探究巨噬細(xì)胞極化特點，我們選用qPCR 方法分別檢測M1 和M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、CRR7和Arg1、Fizz1 mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與NDMCLP 組相比，DMCLP 組腸道組織M1 型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物iNOS、CRR7 表達(dá)明顯增加，M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg1 表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（iNOS：F=137.4，P=0.000；CRR7：F=20.70，P=0.000；Arg1：F=3.42，P=0.07；Fizz1：F=7.59，P=0.01；圖3 B）。

圖3 糖尿病膿毒癥小鼠腸組織M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)升高Fig.3 Increased expression of M1 macrophages in intestinal tissues of diabetic mice after CLP

2.4 腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平

CLP 模型組與相應(yīng)的對照組相比，腸組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 mRNA 表達(dá)明顯上升（P＜0.05）；與NDCLP 組相比，DCLP 組TNF-α、IL-1β 和IL-6 mRNA 表達(dá)升高更加明顯。各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（TNF-α：F=105.9，P=0.000；IL-1β：F=86.63，P=0.000；IL-6：F=42.46，P=0.000；圖4）。

圖4 糖尿病膿毒癥小鼠腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)升高Fig.4 Increased mRNA expression of inflammatory factors in intestinal tissues of mice after CLP

2.5 高糖促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1 極化和炎癥因子的釋放

為了初步觀察高糖與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系，我們采用高糖與LPS 共同刺激巨噬細(xì)胞模擬體外糖尿病合并膿毒癥細(xì)胞模型。流式細(xì)胞檢測顯示，LPS組和HG+LPS組M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD86表達(dá)量增加，但HG+LPS 組更加顯著，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（CD86：F=289.2，P=0.000；圖5 A、B）。同時我們采用qPCR 方法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果顯示與M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD86 表達(dá)情況相似，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué) 意 義（TNF-α：F=94.73，P=0.000；IL-1β：F=149.8，P=0.000；IL-6：F=1406，P=0.000；圖5 C）。

圖5 高糖與LPS共刺激時巨噬細(xì)胞標(biāo)記物和炎癥因子mRNA表達(dá)增加Fig.5 High glucose increased expression of M1 macrophages markers and inflammatory factors mRNA expression in LPScondition

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病合并膿毒癥小鼠腸損傷較非糖尿病小鼠明顯加重，其腸損傷病理評分顯著增加，腸道屏障功能改變。同時，我們發(fā)現(xiàn)糖尿病合并膿毒癥小鼠腸組織中巨噬細(xì)胞浸潤顯著增加，M1巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA 表達(dá)上調(diào)，而M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，這提示M1 型巨噬細(xì)胞可能參與了糖尿病合并膿毒癥小鼠的腸損傷。細(xì)胞實驗進(jìn)一步確認(rèn)LPS 刺激下M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表達(dá)增加，伴炎癥因子基因表達(dá)上調(diào)，更多細(xì)胞向M1型極化，在高糖聯(lián)合LPS 共刺激下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的M1 極化傾向，這提示糖尿病合并膿毒癥時巨噬細(xì)胞更易向M1 型極化，使得腸損傷較非糖尿病小鼠更嚴(yán)重。

高血糖是許多疾病的危險因素［15-18］，包括心血管疾病、腎臟疾病、腸道疾病和膿毒癥。糖尿病合并膿毒癥時腸道損傷特點較少關(guān)注。本實驗采用BKS-DB（Lepr ko/ko）糖尿病小鼠經(jīng)CLP術(shù)建立膿毒癥小鼠模型，觀察其腸道損傷的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病合并膿毒癥時腸損傷更加顯著。腸道屏障功能是人體抵御腸道有害物質(zhì)的重要防線，腸道緊密連接蛋白是腸道機械屏障的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，可通過維持正常的細(xì)胞旁通透性，來達(dá)到防止細(xì)菌代謝產(chǎn)物和大分子有毒物質(zhì)等通過細(xì)胞旁連接入侵機體的作用。緊密連接由跨膜蛋白（Occludin、Claudin-3、Claudin-5）和胞質(zhì)蛋白（ZO-1、ZO-2、ZO-3）組成［19］。Occludin、ZO-1是腸屏障功能的核心。ZO-1缺乏會擾亂細(xì)胞間的緊密連接，因此ZO-1水平降低與腸組織的屏障破壞緊密相有關(guān)［20］。Yoseph［21］等研究驗證了緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1的含量下降與腸道通透性增加的關(guān)系。同樣Wu［22］研究也使用了緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 的含量來證實腸損傷。因此，本研究通過檢測Occludin 和ZO-1 來評估腸道屏障功能損傷情況。分別比較糖尿病或非糖尿病小鼠假手術(shù)組和膿毒癥組，發(fā)現(xiàn)Occludin 和ZO-1 表達(dá)量在膿毒癥組下降顯著，說明膿毒癥造成了顯著的腸道損傷，并且糖尿病合并膿毒癥小鼠的Occludin 和ZO-1 表達(dá)下降最為明顯。這與我們的病理結(jié)果是一致的。Zhong［23］研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腸道黏膜水腫率高達(dá)78.9%，遠(yuǎn)高于健康對照人群。Yuan［24］研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腸道屏障功能受損，且血糖控制不佳與更差的腸道屏障功能相關(guān)。這都提示我們在糖尿病患者中，腸道黏膜水腫，腸道輕度損傷長期存在，在遭遇膿毒癥時極易出現(xiàn)腸道損傷，且腸道損傷程度也會更重。

糖尿病導(dǎo)致的高血糖會觸發(fā)機體的慢性低程度炎癥反應(yīng)，研究表明持續(xù)的高血糖會激發(fā)激活Toll 樣受體誘發(fā)代謝活躍的脂肪細(xì)胞炎癥因子的分泌，進(jìn)而加重全身的慢性代謝性炎癥反應(yīng)［25］。Newton［26］發(fā)現(xiàn)Treg 細(xì)胞功能的缺陷和數(shù)目減少與糖尿病發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。不管糖尿病患者是否存在并發(fā)癥，均出現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞亞群的活性與數(shù)量異常的情況，說明機體處于免疫失衡狀態(tài)。腸巨噬細(xì)胞存在于腸粘膜固有層內(nèi)，是維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和腸道免疫屏障的重要組成部分，同時腸巨噬細(xì)胞也是炎癥反應(yīng)中重要的效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在對抗損傷的過程中根據(jù)微環(huán)境的不同表現(xiàn)出可塑性和多能性，呈現(xiàn)不同的表型。當(dāng)機體遭受細(xì)菌毒素入侵時巨噬細(xì)胞可被大量激活發(fā)揮吞噬、抗原提呈和免疫調(diào)節(jié)作用［27］。M1∕M2 動態(tài)平衡對機體炎癥反應(yīng)程度和疾病轉(zhuǎn)歸具有重要意義［28～29］。Huang等［30］充分討論了M1∕M2 極化狀態(tài)在急性肺損傷過程中的作用，M1 可促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)展，而M2 則發(fā)揮保護(hù)作用。Liu 等［14］研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M1 轉(zhuǎn)化與腸道缺血再灌注損傷密切相關(guān)，逆轉(zhuǎn)這一變化可以改善腸道損傷。我們研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠，腸道巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，M1 型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物iNOS、CRR7 表達(dá)明顯增加，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 表達(dá)上調(diào)，而M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg1 表達(dá)無顯著差異，這與腸道損傷情況一致，提示巨噬細(xì)胞M1型極化，在膿毒癥腸損傷時發(fā)揮重要作用。值得注意的是在糖尿病合并膿毒癥時表達(dá)最多，糖尿病膿毒癥情況下M1 極化趨勢及炎癥因子表達(dá)更加顯著，免疫熒光可見糖尿病腸組織中巨噬細(xì)胞浸潤顯著，細(xì)胞實驗也證實高糖聯(lián)合LPS 共刺激下M1 極化更明顯，因此，我們推測糖尿病的高糖狀態(tài)可能易化了巨噬細(xì)胞向M1 極化，導(dǎo)致糖尿病小鼠合并膿毒癥時腸損傷程度更嚴(yán)重。

本研究的局限性在于僅觀察到糖尿病合并膿毒癥小鼠腸損傷更加嚴(yán)重，高糖時巨噬細(xì)胞更易在LPS 的作用下向M1 極化；對具體的機制與聯(lián)系尚有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明糖尿病合并膿毒癥時腸損傷更加顯著，可能與高血糖時巨噬細(xì)胞更易在LPS的作用下向M1極化有關(guān)。