NMR聯(lián)用HILIC-UPLC-MS/MS 測(cè)定TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠尿液和血漿代謝物變化

劉 雯，孫央雯，鄒寶榮，肖 丹，蔡 穎，劉德亮，廖瓊峰，謝智勇

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院（深圳），廣東深圳 518107；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一類慢性、高復(fù)發(fā)性的胃腸道炎癥性疾病，近年來(lái)在各國(guó)人群中發(fā)病率呈指數(shù)上升，現(xiàn)已成為一種全球化疾病［1］。盡管目前普遍認(rèn)為炎癥性腸病與環(huán)境、飲食、免疫、腸道菌群等諸多因素有關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制迄今尚未得到明確闡述［2］。既往研究表明，炎癥性腸病的動(dòng)態(tài)發(fā)展常伴隨著機(jī)體代謝紊亂［3］。例如，炎癥性腸病會(huì)影響能量代謝與氨基酸代謝途徑，導(dǎo)致該途徑產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝物水平發(fā)生系統(tǒng)性改變，而這些改變會(huì)進(jìn)一步加劇腸道炎癥的發(fā)展［4］。同樣，有臨床研究指出［5］，炎癥性腸病患者尿液中氨基酸和三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的水平較健康人群顯著上升。因此，針對(duì)性地關(guān)注相應(yīng)生物標(biāo)志物如氨基酸類代謝物的變化規(guī)律，對(duì)于炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制的探討有重要的意義。代謝組學(xué)作為研究生物體內(nèi)代謝變化的關(guān)鍵手段，已被普遍應(yīng)用于炎癥性腸病的診斷、監(jiān)測(cè)以及生物標(biāo)志物的篩選等方面。當(dāng)前炎癥性腸病的代謝組學(xué)研究主要為基于單種分析技術(shù)如核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）和 液 質(zhì) 聯(lián) 用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）的非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析［6-8］，其中NMR 和LC-MS 作為代謝組學(xué)的代表方法，各具其特點(diǎn)：NMR 雖擁有預(yù)處理簡(jiǎn)單、低成本的優(yōu)點(diǎn)，但它也存在低靈敏度的局限性；而LC-MS 靈敏度雖高，但樣品前處理時(shí)需要破壞樣品，易導(dǎo)致相關(guān)代謝信息丟失。倘若同時(shí)將多種代謝組學(xué)技術(shù)聯(lián)合使用，則能使有限的代謝信息相互整合，進(jìn)而全面揭示生物體內(nèi)的代謝變化，由此助于炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制的闡明。本研究采用1H NMR 與HILIC-UPLC-MS∕MS（hydrophilic in‐teraction ultra-high-performance liquid chromatogra‐phy-tandem mass spectrometry，HILIC-UPLC-MS∕MS）聯(lián)用的多元代謝組學(xué)方法，以期在分析TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎對(duì)大鼠尿液代謝譜產(chǎn)生影響的同時(shí)，準(zhǔn)確測(cè)定大鼠尿液和血漿中氨基酸類代謝物的水平變化，并篩選出相關(guān)差異代謝物，為炎癥性腸病的機(jī)制研究與關(guān)鍵生物標(biāo)志物的探索提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1240-6460 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；Bruker 600 MHz AVANCE ⅢNMR（德國(guó)Bruker 公司）；BP211D 電子天平（德國(guó)Satori‐us 公司）；SB25-12DTD 超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5425R 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）等。

磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和疊氮化鈉（NaN3）購(gòu)于天津大茂化工試劑廠；三硝基苯磺酸（TNBS）、D2O（含有0.05% TSP，W∕V）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；色譜級(jí)甲酸和甲酸銨購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；色譜級(jí)乙腈購(gòu)于德國(guó)Merck 公司；標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；髓過(guò)氧化物酶（My‐eloperoxidase，MPO）試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和樣本收集

成年SPF級(jí)雄性SD大鼠（180～200 g）由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。將大鼠置于溫度（20～22）℃、濕度（50%～70%）以及12 h 明暗循環(huán)的環(huán)境中常規(guī)飲食飼養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)操作均符合中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理要求并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則進(jìn)行。經(jīng)一周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，16 只大鼠被隨機(jī)分成兩組進(jìn)行造模，即對(duì)照組（Control）和模型組（Model），給予模型組大鼠結(jié)腸灌入0.25 mL TNBS 溶液（30 mg∕mL，溶于50%乙醇），對(duì)照組灌入等量乙醇溶液，造模后常規(guī)飼養(yǎng)。

于造模前1 d 和造模后1、3、5 和7 d 用代謝籠采集大鼠尿樣，離心取上清并保存待用。于造模后第3 天（day 3），每組取2 只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉以收集結(jié)腸組織。于造模后第7天（day 7），對(duì)余下大鼠用水合氯醛麻醉并進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，離心得到血漿樣品，同時(shí)收集結(jié)腸組織。

1.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定

將結(jié)腸組織于10%福爾馬林溶液中固定48 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后制成蘇木精伊紅（haematoxylin and eosin，HE）組織切片，參考文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)腸損傷程度進(jìn)行評(píng)估［9］。髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性測(cè)定按說(shuō)明書(shū)操作。

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性，則組間比較采用t檢驗(yàn)，反之采用校正t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 NMR代謝組學(xué)檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

1.4.1 樣品前處理 吸取550 μL 尿樣于離心管，加入55μL磷酸鹽緩沖液（1.5 mol∕L，K2HPO4：NaH2PO4=4：1，用含0.1%NaN3和D2O 配制）渦旋1 min 后再離心10 min（15 000 ×g，4 °C），并將550 μL上清液轉(zhuǎn)移至核磁管。

1.4.2 數(shù)據(jù)采集 使用NOESY1D 脈沖序列（RDG1-90°-t1-90°-tm-G2-90°-ACQ）采集信號(hào)，參數(shù)設(shè)置：采樣溫度298 K，采樣點(diǎn)數(shù)32 K，采樣時(shí)間2 s，累加次數(shù)64 次，混合時(shí)間80 ms，90°脈沖寬度11 μs，譜寬12 kHz［10］。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 采用TOPSPIN 軟件（V3.2，Bruk‐er Biospin，Germany）對(duì)1H NMR 圖譜進(jìn)行相位和基線校正，以TSP 信號(hào)（δ 0.00）定標(biāo)，利用AMIX 軟件（V3.2，Bruker Biospin，Germany）對(duì)圖譜δ 0.50～9.50 區(qū)間分段積分，積分間隔0.004 ppm，同時(shí)去除水峰（δ 4.72～4.88）和尿素峰（δ 5.50～6.00）。

1.4.4 多變量統(tǒng)計(jì)分析 基于SIMCA-P 軟件（V12.0，Umetrics，Sweden）對(duì)歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（Principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial leastsquares discriminant analysis，OPLS-DA），并根據(jù)R2X、R2Y、Q2Y 和交叉驗(yàn)證結(jié)果評(píng)估模型可信度，數(shù)據(jù)使用Pareto 規(guī)格化（Pareto variance，Par）處理［11］?；贠PLS-DA，計(jì)算變量投影重要度（variable im‐portance for the projection，VIP），結(jié)合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），以VIP ＞1 和P＜0.05為條件篩選差異代謝物。

1.5 HILIC-UPLC-MS/MS代謝組學(xué)檢測(cè)

1.5.1 樣品前處理 參考文獻(xiàn)［12］的方法，吸取30μL尿液或血漿樣本，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液（10μg∕mL L-2-氨基丁酸，6-巰鳥(niǎo)嘌呤，3，4-二羥基苯甲酸，5-羥基吲哚-2-羧酸）和140 μL 乙腈，渦旋混勻5 min 后離心10 min（16 000×g），吸取2 μL上清液進(jìn)樣分析。

1.5.2 色譜、質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為AC‐QUITY UPLC? BEH Amide 柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA），接有VanGuard保護(hù)柱（5 mm× 2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA）。流動(dòng)相A 相為20 mmol∕L 甲酸銨溶液（含0.25%甲酸），B相為乙腈（含20 mmol∕L 甲酸銨和0.2%甲酸），流速0.5 mL ∕min，梯度洗脫（0～2.6 min，100% B；2.7～4.0 min，100% B→90% B；4.1～6.5 min，90% B→70% B）。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，電離電壓3.5 kV，噴嘴電壓500 V，毛細(xì)管溫度300 °C，鞘氣流速11 L∕min，干燥器溫度350°C，霧化器壓力40 psi。

1.6 數(shù)據(jù)處理

基于SIMCA-P 軟件（V12.0，Umetrics，Swe‐den），采用OPLS-DA 分析并結(jié)合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)篩選差異代謝物（P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生理生化指標(biāo)與組織病理學(xué)檢查

經(jīng)TNBS 造模后，結(jié)腸炎模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢，同時(shí)還表現(xiàn)出腹瀉癥狀，但在造模3 d以后，模型組大鼠腹瀉癥狀逐漸得到緩解，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前消失。

模型組大鼠組織評(píng)分高于對(duì)照組（圖1A），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，該組大鼠結(jié)腸組織MPO 水平也顯著高于對(duì)照組（圖1B）。相較于對(duì)照組大鼠的結(jié)腸組織特征（圖1C），造模3 d 后模型組大鼠結(jié)腸組織切片中可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞和隱窩數(shù)量減少、黏膜層局部潰瘍，且造模7 d后模型組大鼠結(jié)腸組織切片中仍可觀察到黏膜輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。綜合以上結(jié)果，提示TNBS 成功誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型。

圖1 TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型評(píng)估Fig.1 Evaluation of TNBS-induced colitis model in rats

2.2 NMR代謝組學(xué)分析

圖2 為造模3 d 后模型組與對(duì)照組大鼠尿液代謝物的代表性1H NMR 圖譜，基于該圖譜與公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB（http：∕∕www.hmdb.ca∕）對(duì)代謝物進(jìn)行比對(duì)，共歸屬出49 種代謝物，主要包括糖類（β-葡萄糖、糖原、乳糖和木糖），氨基酸類（甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸和異亮氨酸），有機(jī)酸類（三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物），胺類（甲胺、二甲胺）和腸道菌群-宿主共代謝物（馬尿酸鹽、對(duì)甲酚硫酸鹽、對(duì)甲酚葡萄糖苷、苯乙尿酸）等。

圖2 造模3 d后對(duì)照組和模型組大鼠尿液的代表性1H NMR圖譜Fig.2 Representative 1H NMR spectra of urine in the control and model groups at day 3

采用OPLS-DA分析結(jié)腸炎大鼠尿液代謝物的動(dòng)態(tài)變化，代謝輪廓軌跡圖（圖3A）顯示出模型組大鼠尿液代謝輪廓變化的時(shí)間依賴性，且偏離程度隨時(shí)間推移逐漸增大，并于造模3 d 后偏離達(dá)到最大，此后差異逐漸縮小，但最終與造模前仍未能重合。綜合OPLS-DA 軌跡圖與組織病理學(xué)特征，表明模型組大鼠在造模3 d 后的疾病程度最為嚴(yán)重。因此，對(duì)造模3 d 后大鼠尿液代謝物的變化情況進(jìn)行分析。OPLS-DA 負(fù)載圖中紅色標(biāo)記點(diǎn)代表VIP ＞1 的潛在差異代謝物（圖3B），結(jié)合VIP ＞1 且P＜0.05 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選得到6 個(gè)差異代謝物（圖4、表1），其中丙酮酸、甲酸、甲胺、檸檬酸水平在模型組大鼠尿液中顯著升高，而氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）和丙二酸水平則明顯降低。

圖3 模型組大鼠尿液的OPLS-DA代謝輪廓軌跡圖與負(fù)載圖Fig.3 Metabolic trajectory plot and loading plot of urine in the model group based on OPLS-DA

2.3 HILIC-UPLC-MS/MS代謝組學(xué)分析

為進(jìn)一步探究結(jié)腸炎對(duì)大鼠氨基酸類代謝物的影響，利用HILIC-UPLC-MS∕MS 測(cè)定對(duì)照組和模型組大鼠尿液和血漿氨基酸組成。從整體上看，TNBS 誘導(dǎo)后，模型組與對(duì)照組大鼠尿液和血漿代謝組均呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)（圖4A、B）。從差異代謝物具體變化趨勢(shì)來(lái)看，模型組大鼠尿液中苯丙氨酸和組氨酸含量升高，而血漿樣品中賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、色氨酸、脯氨酸、組氨酸和酪氨酸含量顯著升高，但谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸和異亮氨酸含量下降（圖4C、表1）。

表1 模型組大鼠尿液、血漿差異代謝物及變化趨勢(shì)Table 1 Differential metabolites and its variation tendency of urine and plasma in the model group

圖4 對(duì)照組和模型組大鼠尿液與血漿的OPLS-DA得分圖與標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖Fig.4 Score plots and standardized coefficients plots of urine and plasma in the control and model groups based on OPLS-DA

3 討論

炎癥性腸病作為一種胃腸道慢性疾病，其主要特征之一即是對(duì)機(jī)體的體液代謝造成影響，包括糞便、尿液和血液中的代謝輪廓都會(huì)隨炎癥性腸病的發(fā)展而改變［13］。其中，尿液與血液樣本在炎癥性腸病生物標(biāo)志物的篩查方面具有一定潛力，如尿液代謝物中的前列腺素E 可用于預(yù)測(cè)結(jié)腸炎的復(fù)發(fā)情況［14］，而血液中的C 反應(yīng)蛋白是臨床用于檢測(cè)腸道急性炎癥的關(guān)鍵指標(biāo)［15］。此外，當(dāng)前較被認(rèn)可的炎癥性腸病動(dòng)物造模方法主要是三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）∕乙醇灌注法［16］，利用該法獲得的結(jié)腸炎動(dòng)物模型因腸道組織學(xué)變化與人體基本相似而被廣泛運(yùn)用于炎癥性腸病的研究中。由此，本研究采用TNBS 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠模型，再聯(lián)用1H NMR 和HILIC-UPLCMS∕MS 對(duì)結(jié)腸炎大鼠的尿液和血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析?；诜前袠?biāo)結(jié)合靶標(biāo)代謝組學(xué)的分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)TNBS在不同程度上影響了結(jié)腸炎大鼠的能量代謝、胺類代謝和氨基酸代謝途徑（圖5）。

圖5 TNBS誘導(dǎo)對(duì)大鼠代謝通路的影響Fig.5 Metabolic pathways influenced by TNBS induction in rats

三羧酸（TCA）循環(huán)中間產(chǎn)物的水平能反映機(jī)體對(duì)能量的需求。TNBS 誘導(dǎo)后，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠尿液丙酮酸和檸檬酸水平升高。與之相似，Dong 等［10］通過(guò)對(duì)結(jié)腸炎小鼠的尿液代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其尿液代謝譜在造模1 d后迅速改變，且尿液中檸檬酸、酮戊二酸等與能量代謝相關(guān)的代謝物含量顯著增加。鑒于TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物在細(xì)胞能量代謝中的重要作用，我們推測(cè)其水平增高的原因可能是腸道炎癥使結(jié)腸炎大鼠需要增強(qiáng)TCA 等能量代謝活動(dòng)而為受損腸屏障的修復(fù)提供足夠的能量，因此結(jié)腸炎大鼠尿液中檸檬酸與丙酮酸水平的增加很可能與腸道炎癥密切相關(guān)。

在胺類代謝方面，氧化三甲胺（TMAO）主要有兩條來(lái)源：腸道細(xì)菌的代謝以及飲食攝入。由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠的飲食均未改變，因此大鼠尿液中TMAO 水平改變可能是由TNBS 對(duì)腸道菌群穩(wěn)態(tài)造成破壞所引起的。我們發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠尿液TMAO 含量較對(duì)照組顯著降低，而這一結(jié)果正與Wilson 等［17］的研究結(jié)果相符。此外，我們還觀察到其他細(xì)菌代謝物如甲胺在模型大鼠尿液中含量顯著升高。文獻(xiàn)表明，甲胺的脫氨作用會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，并使甲胺毒性增強(qiáng)，且甲胺水平升高的同時(shí)也會(huì)使其代謝產(chǎn)物甲醛增多，而甲醛已被證實(shí)能對(duì)內(nèi)皮造成損傷［18-19］。于此，模型組大鼠尿液中甲胺水平的改變很可能提示其腸道潛在的炎癥與內(nèi)皮受損。

由于腸道炎癥會(huì)造成氨基酸代謝途徑紊亂，因此氨基酸類代謝物被認(rèn)為是與結(jié)腸炎相關(guān)的重要生物標(biāo)志物［20］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠尿液和血漿中共計(jì)9 種氨基酸水平上調(diào)，究其原因，可能有：①結(jié)腸炎會(huì)對(duì)宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)造成破壞［5］，而氨基酸作為腸道菌群-宿主共代謝物，其水平改變與結(jié)腸炎大鼠腸道菌群失調(diào)存在一定關(guān)聯(lián)；②因?yàn)榻Y(jié)腸炎大鼠對(duì)能量需求增加，機(jī)體需要加速蛋白質(zhì)降解和氨基酸生物轉(zhuǎn)化以增加能量供應(yīng)，由此影響氨基酸水平；③由于炎癥對(duì)腸道的刺激，會(huì)影響結(jié)腸對(duì)氨基酸的吸收利用，導(dǎo)致尿液和血漿中氨基酸含量增加，而這也側(cè)面反映了結(jié)腸炎大鼠腸道屏障受損。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)有趣的差異代謝物——賴氨酸和纈氨酸。文獻(xiàn)報(bào)道［21］，當(dāng)腸道存在炎癥時(shí)，精氨酸能減輕炎癥對(duì)腸道的損傷，但賴氨酸水平升高時(shí)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制CAT1 轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)精氨酸的攝取，從而妨礙其發(fā)揮功能并加劇腸道炎癥［6］。纈氨酸是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞因子等過(guò)程中的必需氨基酸，當(dāng)其在體內(nèi)水平不足時(shí)，會(huì)影響機(jī)體免疫應(yīng)答［22］。鈣衛(wèi)蛋白，作為一種對(duì)黏膜炎癥高度特異的生物標(biāo)志物，在臨床被廣泛用于結(jié)腸炎的診斷和疾病程度的評(píng)估。通常情況下，鈣衛(wèi)蛋白含量越高，則提示腸道炎癥越嚴(yán)重。有研究表明，結(jié)腸炎患者體內(nèi)鈣衛(wèi)蛋白的含量與賴氨酸水平成正比、與纈氨酸水平成反比［6，22］，這與我們?cè)谀Ｐ痛笫篌w內(nèi)觀察到的賴氨酸水平升高、纈氨酸水平降低的結(jié)果一致?；诖?，我們認(rèn)為賴氨酸和纈氨酸有潛力成為結(jié)腸炎相關(guān)的重要生物標(biāo)志物，在臨床研究中可以通過(guò)對(duì)這兩種氨基酸的水平進(jìn)行檢測(cè)以輔助炎癥性腸病的診斷，同時(shí)結(jié)合鈣衛(wèi)蛋白等指標(biāo)綜合分析以提高診斷與評(píng)估結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血漿中谷氨酰胺水平顯著降低。谷氨酰胺具有改善腸屏障、緩解腸道炎癥等功能［23］，然而受腸道炎癥影響，模型組大鼠氨基酸代謝失調(diào)，導(dǎo)致血漿中谷氨酰胺水平降低。以上結(jié)果提示谷氨酰胺不僅能作為生物標(biāo)志物指示腸道炎癥，同時(shí)膳食補(bǔ)充谷氨酰胺或許可以作為一種預(yù)防或治療炎癥性腸病的輔助療法。

Nong 等［2］的研究也指出，TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠尿液中氨基酸代謝途徑受到干擾。但與我們觀察到的差異代謝物不一樣的是，他們發(fā)現(xiàn)苯乙醛的水平在模型大鼠尿液中顯著降低，并猜測(cè)苯乙醛的減少與苯丙氨酸-4-羥化酶有關(guān)，后者作為一種苯丙氨酸代謝酶，在腸道存在炎癥和損傷時(shí)含量降低，進(jìn)而減少其對(duì)苯丙氨酸的代謝，但他們并未檢測(cè)到苯丙氨酸的變化。而在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠尿液與血漿中苯丙氨酸含量均顯著上升，這一結(jié)果不僅是對(duì)前人研究結(jié)果與猜想的補(bǔ)充與驗(yàn)證，也表明了苯丙氨酸作為生物標(biāo)志物的潛力。同時(shí)，Tao等［24］通過(guò)對(duì)結(jié)腸炎大鼠尿液與血漿代謝組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎對(duì)大鼠代謝途徑的影響主要集中于磷脂與膽堿、血脂代謝等，雖然與我們觀察到的代謝途徑不一致，但以上代謝途徑紊亂也同樣提示了TNBS引起的腸道上皮受損與結(jié)腸炎癥，并與我們結(jié)果所反映的結(jié)腸炎大鼠生理變化相吻合。

綜上所述，本研究首先采用1H NMR 技術(shù)從整體角度分析結(jié)腸炎大鼠尿液代謝輪廓變化，同時(shí)為了彌補(bǔ)1H NMR 靈敏度低的缺陷，再與HILICUPLC-MS∕MS 技術(shù)結(jié)合以對(duì)結(jié)腸炎大鼠尿液和血漿中與腸道炎癥密切相關(guān)的氨基酸類代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。通過(guò)對(duì)兩種不同儀器平臺(tái)的分析方法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，不但從多方面獲得準(zhǔn)確的代謝組學(xué)信息，也能避免使用單一方法帶來(lái)的局限性?；?H NMR聯(lián)用HILIC-UPLC-MS∕MS的多元分析技術(shù)，可以較為全面且深入地揭示結(jié)腸炎大鼠體內(nèi)相關(guān)代謝物的變化規(guī)律，為炎癥性腸病的機(jī)制研究、臨床診斷以及關(guān)鍵生物標(biāo)志物的篩選提供新的研究思路。