黃芪多糖對小鼠慢性腎功能衰竭保護(hù)作用的機(jī)制研究

楊潔珂，王麗，于千惠，刁會(huì)，樊均明，2△

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）在世界范圍內(nèi)已被視為重要公共衛(wèi)生問題［1］。內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞浸潤、毒素蓄積進(jìn)一步加快了終末期腎 ?。╡nd-stage renal disease，ESRD）發(fā) 展 的 進(jìn)程［2-3］。近年來，隨著“腸-腎軸”理論的提出，研究顯示腸道微生態(tài)與CKD之間存在密切聯(lián)系［4］。人體腸道由益生菌和機(jī)會(huì)致病菌維持著“動(dòng)態(tài)平衡”［5］。研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎功能衰竭患者中，尤其是ESRD患者，長期代謝蓄積體內(nèi)的廢物，致血液內(nèi)毒素濃度過高而透過腸壁血管進(jìn)入腸腔，引起腸道微生態(tài)改變，導(dǎo)致菌群失調(diào)［6］。而失調(diào)的菌群又可導(dǎo)致腸道功能紊亂，蛋白質(zhì)降解受阻，毒素蓄積，從而進(jìn)一步加重CKD的進(jìn)展［7］。與此同時(shí)，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的生物學(xué)功能受到關(guān)注。根據(jù)最新研究結(jié)果，lncRNA在CKD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［8］。因此，探究lncRNA在“腸-腎軸”中的功能可能是一種新近治療思路。黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是傳統(tǒng)中藥黃芪中的主要成分之一，具有明確的抗炎、抗氧化、抗纖維化、調(diào)節(jié)菌群等作用［9-11］。但黃芪多糖是否在腸、腎發(fā)揮聯(lián)動(dòng)調(diào)節(jié)作用仍未明確。本研究旨在從腸道微生態(tài)角度，探討黃芪多糖對慢性腎功能衰竭小鼠的保護(hù)作用，以闡明其可能的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡雄性健康Balb/c小鼠30只，體質(zhì)量18～22 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030。將所有動(dòng)物置于溫度和濕度受控的房間中飼養(yǎng)，溫度（21.0±2.0）℃，濕度（65±5）%，自由飲水，并保持12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器 黃芪多糖（純度：HPLC＞95%；Macklin，A860847）。總RNA提取試劑盒（Tiangen，DP419）；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒KitHiScript?ⅢRT SuperMix（+gDNA wiper）（Vazyme，7E34219）；糞便基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，DP328）；肌酐（Scr）肌氨酸氧化酶法試劑盒（南京建成，C011-2-1）；尿素氮（BUN）脲酶法試劑盒（南京建成，C013-2-1）；尿蛋白定量（CBB法）測試盒（南京建成，C011-2-1）；鏈霉卵白素-生物素標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗（中杉金橋，SP-9001、SP-9002）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（Neobioscience，EMC102a、EMC001b、EMC004）；鼠抗鼠緊密連接蛋白-1（ZO-1、Claudin-1、Occludin-1）單 克 隆 抗 體（Life technologies，QG215365、QD215273、QH215846），小鼠抗鼠核因子κB（NF-κB）單克隆抗體（Bioss，bs-0465R）；兔抗鼠p-NF-κB單克隆抗體（CST，#3033）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天，A0208、A0216）二抗。ECL凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，USA）；Light Cycler?480II PCR儀（Roche，Swiss）；VS120虛 擬數(shù)字切片顯微鏡（Olympus，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模 將30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、慢性腎功能衰竭模型組（模型組）和黃芪多糖干預(yù)組（APS組），每組10只。1%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）腹腔注射，無菌條件下分別沿后正中線左側(cè)0.5 cm，肋弓下緣0.5 cm處做手術(shù)切口，游離左側(cè)腎臟，模型組和APS組予以左腎切除并逐層縫合切口，假手術(shù)組只游離腎臟不切除并縫合切口。術(shù)后繼續(xù)正常喂養(yǎng)1周，將模型組和APS組予以右腎的上1/3和下1/3結(jié)扎，將右腎等分為腎上、中、下三部分并縫合切口，假手術(shù)組同樣只游離腎臟不結(jié)扎并縫合切口。術(shù)后正常喂養(yǎng)7周，隨后APS組給予APS 100 mg（/kg·d）灌胃，其余2組給予等體積生理鹽水連續(xù)灌胃。4周后行心臟取血并處死小鼠，處死前1 d各組小鼠置于代謝籠飼養(yǎng)，收集小鼠24 h尿液和糞便。處死后收集小鼠血清及右腎中部、結(jié)腸組織樣本，部分置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后乙醇梯度脫水、石蠟包埋切片；剩余部分凍存于-80℃冰箱進(jìn)行后續(xù)分析。5/6腎切除模型造模期間，模型組死亡2只；灌胃期間模型組小鼠死亡2只，APS組死亡1只；小鼠出現(xiàn)死亡及時(shí)補(bǔ)充造模。

1.2.2 血清Scr、BUN、24 h尿蛋白定量檢測 心臟采血后于4℃靜置過夜，隨后3 000 r/min離心15 min吸取上層血清。準(zhǔn)備好收集的血清、尿液按照操作說明書分別檢測血清Scr、BUN和24 h尿蛋白定量。

1.2.3 HE、天狼星紅染色 將切片置于65℃烤箱烘烤2 h，予以二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水。蘇木素滴染2 min，自來水沖洗；伊紅浸染1 min，自來水沖洗行HE染色。天狼星紅浸染2 h，自來水沖洗，蘇木素染核3 min，自來水沖洗行天狼星紅染色。脫水透明封片后置于光鏡下觀察腎臟和腸道的結(jié)構(gòu)改變及腎臟纖維沉積情況。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測緊密連接蛋白-1家族及p-NF-κB表達(dá)水平 切片置于65℃烤箱烘烤2 h，予以二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水。予檸檬酸三鈉抗原修復(fù)，晾至室溫后滴加過氧化氫阻斷劑10 min，封閉液15 min，滴加鼠抗ZO-1、Claudin-1、Occludin-1一抗，兔抗p-NF-κB一抗（1∶150），4℃孵育過夜，分別滴加對應(yīng)抗小鼠、抗兔二抗后常溫孵育1 h，DAB顯色劑顯色，蘇木素染核數(shù)秒，無水乙醇脫水，二甲苯透明。封片后置于光鏡下觀察免疫復(fù)合物沉積情況。

1.2.5 ELISA檢測IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平 收集小鼠血清，按試劑盒操作說明分別檢測各組IL-1β、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子水平。

1.2.6 Western blot檢測緊密連接蛋白-1家族及p-NF-κB蛋白水平 各組取適量結(jié)腸及腎臟皮質(zhì)樣本于RIPA蛋白裂解液和PMSF混合液中充分裂解30 min提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白濃度，加Loading Buffer煮沸后取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的ZO-1、Claudin-1、Occludin-1、p-NF-κB、NF-κB（1∶1 000）、GAPDH（1∶50 000）一抗于4℃搖床過夜，次日TBST洗膜后加入帶HRP標(biāo)記山羊抗兔、抗鼠二抗（1∶2 000）于室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液于Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)成像。以Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的比值以及p-NF-κB與NF-κB的比值，進(jìn)行定量分析。

1.2.7 總RNA及糞便基因組DNA的提取 各組取適量腎臟皮質(zhì)樣本，在Trizol裂解液中充分裂解，按照RNA simple Total RNA Kit試劑盒說明書提取總RNA，測RNA濃度，參照試劑盒說明書制備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取適量新鮮糞便樣本根據(jù)糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取糞便DNA，測定樣品DNA濃度及A260/A280比值，比值在1.8左右為佳，否則重提。

1.2.8 qPCR檢測促炎細(xì)胞因子、糞便菌群的表達(dá)量 在LightCycler?480Ⅱ儀器上進(jìn)行qPCR檢測腎臟組織中l(wèi)ncRNA Arid2-IR及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過比較循環(huán)閾值2-ΔΔCt分析結(jié)果。檢測糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌的表達(dá)量，采用細(xì)菌16 s rRNA V3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對照［12］，通過循環(huán)閾值2-ΔΔCt分析結(jié)果。整個(gè)擴(kuò)增程序：95℃10 min預(yù)變性，40個(gè)循環(huán)（95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s）變性、退火、延伸；每個(gè)樣本均設(shè)置3次重復(fù)，基因引物及細(xì)菌引物序列見表1，引物由上海生物工程有限公司合成。

Tab.1 The primer sequences of qPCR表1 qPCR所用引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用±s表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用One-way ANOVA，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS對CKD小鼠腎功能的影響 與假手術(shù)組相比，模型組和APS組Scr、BUN和24 h尿蛋白總量均明顯升高，而APS組Scr、BUN和24 h尿蛋白較模型組均顯著下降（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of Scr,BUN and 24 h urine protein content between the three groups of mice表2各組小鼠Scr、BUN及24 h尿蛋白含量的比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of Scr,BUN and 24 h urine protein content between the three groups of mice表2各組小鼠Scr、BUN及24 h尿蛋白含量的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）24 h尿蛋白總量（mg/L）假手術(shù)組7.85±1.266.26±0.771.72±0.30模型組147.80±10.68a19.34±1.98a6.42±0.15a APS組59.70±5.15ab12.86±1.53ab4.54±0.37ab F528.532＊＊93.374＊＊201.827＊＊

2.2 APS對CKD小鼠腎臟和結(jié)腸病理損傷的影響 腎臟HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組腎小球明顯萎縮硬化，腎小管擴(kuò)張明顯，伴隨腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落；APS組腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少，管腔擴(kuò)張程度減輕，腎小球形態(tài)稍有恢復(fù)，見圖1。天狼星紅染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組染色陽性區(qū)域明顯，腎纖維化程度嚴(yán)重；而APS組纖維化程度明顯改善，見圖2。HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組結(jié)腸黏膜上皮完整，絨毛排列整齊；模型組黏膜上皮脫落糜爛，絨毛縮短，數(shù)量減少，刷狀緣不連續(xù)，固有層水腫明顯，炎細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞增多；APS組絨毛高度有所恢復(fù)，刷狀緣連續(xù)性有所改善，炎細(xì)胞減少，腸黏膜損傷較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，但仍存在水腫，見圖3。

Fig.1 The effect of APS on mouse kidney tissue structure(HE staining,×200)圖1 APS對小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響（HE染色，×200）

Fig.2 The effect of APS on kidney fiber deposition in mice(sirius red stain,×200)圖2 APS對小鼠腎臟纖維沉積的影響（天狼星紅染色，×200）

Fig.3 The effect of APS on the morphology of mouse colonic epithelium(HE staining,×200)圖3 APS對小鼠結(jié)腸上皮組織形態(tài)的影響（HE染色，×200）

Fig.4 The effect of APS on Claudin-1 expression in mouse colon tissues(immunohistochemical staining,×200)圖4 APS對小鼠結(jié)腸組織Claudin-1表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×200）

Fig.5 The effect of APS on Occludin-1 expression in mouse colon tissues(immunohistochemical staining,×200)圖5 APS對小鼠結(jié)腸組織Occludin-1表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×200）

Fig.6 The effect of APS on ZO-1 expression in mouse colon tissues(immunohistochemical staining,×200)圖6 APS對小鼠結(jié)腸組織ZO-1表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×200）

Fig.8 The effect of APS on the expression of p-NF-κB in mouse kidney tissues(immunohistochemical staining,×200)圖8 APS對小鼠腎臟組織p-NF-κB表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.3 APS對CKD小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin-1及ZO-1表達(dá)水平的影響 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1、Occludin-1、ZO-1蛋白均呈蜂窩狀或點(diǎn)狀聚集，并均勻分布在腸上皮細(xì)胞頂端，模型組3種蛋白零散且分布不均，APS組可見緊密連接蛋白表達(dá)有所恢復(fù)并均勻分布，見圖4～6。Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組與APS組結(jié)腸組織Claudin-1、Occludin-1、ZO-1蛋白表達(dá)明顯下降，而APS組3種蛋白的表達(dá)量較模型組明顯升高（P＜0.01），見圖7、表3。

Fig.7 Protein levels of Claudin-1,Occludin-1 and ZO-1 in mouse colon tissue of the 3 groups圖7 Western blot檢測3組小鼠結(jié)腸組織中Claudin-1、Occludin-1和ZO-1蛋白水平

Tab.3 Comparison of expression levels of Claudin-1,Occludin-1 and ZO-1 in colonic tissues of mice between the three groups表3各組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1,Occludin-1及ZO-1蛋白的表達(dá)水平比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of Claudin-1,Occludin-1 and ZO-1 in colonic tissues of mice between the three groups表3各組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1,Occludin-1及ZO-1蛋白的表達(dá)水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別Claudin-1Occludin-1ZO-1假手術(shù)組1.69±0.131.32±0.102.01±0.09模型組0.59±0.07a0.48±0.04a1.06±0.11a APS組0.87±0.13ab0.56±0.02ab1.44±0.15ab F 77.892＊＊177.000＊＊49.022＊＊

2.4 APS對CKD小鼠炎癥反應(yīng)的影響qPCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平明顯升高，而APS組較模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)均明顯下降（P＜0.05），見表4。ELISA檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著升高，而APS組較模型組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)下降（P＜0.05），見表5。

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in renal tissues of mice between the three groups表4各組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in renal tissues of mice between the three groups表4各組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α假手術(shù)組1.11±0.201.03±0.301.02±0.24模型組3.13±0.30a2.88±0.57a3.46±0.68a APS組2.07±0.21ab1.87±0.54ab2.42±0.31ab F 57.550＊＊10.910＊21.620＊＊

Tab.5 Comparison of the serum expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α between the three groups of mice表5各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.5 Comparison of the serum expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α between the three groups of mice表5各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α假手術(shù)組0.03±0.010.12±0.140.23±0.04模型組0.11±0.02a1.12±0.23a0.82±0.08a APS組0.07±0.01ab0.66±0.14ab0.54±0.05ab F 21.384＊＊24.943＊＊77.734＊＊

2.5 APS對腎臟組織NF-κB活化的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)相比，模型組腎小球及腎間質(zhì)有大量p-NF-κB沉積，而APS組p-NF-κB沉積較模型組明顯減少，見圖8。Western blot結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組和APS組p-NF-κB蛋白表達(dá)量分別為0.89±0.02、1.25±0.11和1.12±0.15，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=10，F(xiàn)=8.671，P＜0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯上升，而APS組p-NF-κB蛋白表達(dá)量較模型組明顯下降（P＜0.05），見圖9。

2.6 APS對腎臟組織lncRNA Arid2-IR的影響 腎臟組織qPCR結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組和APS組lncRNA Arid2-IR表達(dá)水平分別為1.10±0.26、4.25±0.30和3.24±0.34（n=10，F(xiàn)=8.671，P＜0.01）。與假手術(shù)組相比，模型組中l(wèi)ncRNA Arid2-IR的表達(dá)明顯升高，而APS組中l(wèi)ncRNA Arid2-IR較模型組表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。

Fig.9 Protein levels of p-NF-κB in mouse kidney cortex of the three groups圖9 Western blot檢測3組小鼠腎皮質(zhì)中p-NF-κB蛋白水平

2.7 APS對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用 小鼠糞便的qPCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組的大腸桿菌表達(dá)量明顯升高，乳酸桿菌、雙歧桿菌的表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而APS組乳酸桿菌、雙歧桿菌的表達(dá)量較模型組有所升高，大腸桿菌的表達(dá)量出現(xiàn)下降（P＜0.05），見表6。

Tab.6 Comparison of expression levels of probiotics and opportunistic pathogens in feces of each group of mice表6各組小鼠糞便中益生菌及機(jī)會(huì)致病菌表達(dá)量的比較（n=10，±s）

Tab.6 Comparison of expression levels of probiotics and opportunistic pathogens in feces of each group of mice表6各組小鼠糞便中益生菌及機(jī)會(huì)致病菌表達(dá)量的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別 乳酸桿菌 雙歧桿菌 大腸桿菌假手術(shù)組1.01±0.211.00±0.141.01±0.19模型組0.18±0.03a0.09±0.02a10.76±1.81a APS組0.55±0.01ab0.43±0.13ab5.64±1.28ab F 34.452＊＊55.232＊＊43.166＊＊

3 討論

人體腸道內(nèi)有成百上千種菌群，健康的菌群環(huán)境可參與腸壁保護(hù)、毒素代謝、免疫調(diào)節(jié)等，失調(diào)的菌群環(huán)境亦可誘發(fā)、加重腎臟疾?。?］。這與中醫(yī)認(rèn)為慢性腎功能衰竭的基本病機(jī)為脾腎虧虛、濕濁內(nèi)阻一致［13］。兩者互為因果，相互作用。

在前期研究中［14］，本課題組對我院臨床用于治療慢性腎病的中藥復(fù)方黃芪三七合劑干預(yù)治療5/6腎結(jié)扎誘導(dǎo)的慢性腎功能衰竭小鼠進(jìn)行腸道菌群分析，發(fā)現(xiàn)腎功能衰竭小鼠細(xì)菌的類別發(fā)生了一定變化，其中有益菌雙歧桿菌、乳酸桿菌的菌群豐度顯著降低，但有害菌大腸桿菌的菌群豐度明顯升高，與文獻(xiàn)［15］報(bào)道相一致。研究表明，菌群失調(diào)可激活機(jī)體NF-κB，產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)，破壞腸道黏膜機(jī)械屏障完整性，導(dǎo)致毒素通過腸壁血管進(jìn)入血液，進(jìn)一步加重CKD患者腎臟負(fù)荷［16-18］。目前，已有研究證實(shí)lncRNA可參與介導(dǎo)CKD的發(fā)生發(fā)展，其中l(wèi)ncRNA np_28496啟動(dòng)子區(qū)域包含了Smad3的結(jié)合位點(diǎn)，因其位于Arid2基因的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，又稱lncRNA Arid2-IR。研究發(fā)現(xiàn)該lncRNA在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠誘導(dǎo)的腎功能衰竭模型腎臟中高表達(dá)［19］。另有研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的炎癥，NF-κB活化后可激活下游促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，本課題組前期在糖尿病腎病模型中得到同樣結(jié)論［20］。因此，通過介導(dǎo)lncRNA Arid2-IR“從腸治腎”也許是治療慢性腎病的新的方向。

本研究進(jìn)一步探索了黃芪主成分APS對“腸-腎軸”的調(diào)節(jié)作用。血清Scr、BUN、24 h尿蛋白檢測結(jié)果顯示黃芪多糖治療可明顯改善腎功能衰竭小鼠的腎臟功能；HE染色及天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)APS治療后腎功能衰竭小鼠腎臟及結(jié)腸的病理損傷、腎臟纖維沉積均得到了改善；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)慢性腎功能衰竭模型組小鼠的炎性因子表達(dá)明顯升高，提示機(jī)體處于持續(xù)的全身炎癥狀態(tài)。與此同時(shí)，模型組腸道緊密連接蛋白家族中Claudin-1、Occludin-1和ZO-1的表達(dá)均明顯下降，而這些蛋白在維持腸道正常生理功能中起著重要作用，其表達(dá)量降低提示腸黏膜破壞嚴(yán)重，屏障功能受損［21］。經(jīng)APS治療后，慢性腎功能衰竭小鼠腎組織中l(wèi)ncRNA Arid2-IR及p-NF-κB水平均明顯下調(diào)，炎性因子表達(dá)下降，而腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)增加。提示系統(tǒng)炎癥以及腸道屏障損傷均明顯改善，腸壁得到了修復(fù)，表明APS對慢性腎功能衰竭小鼠的結(jié)腸腸道屏障具有保護(hù)作用，且該作用可能通過抑制lncRNA Arid2-IR及其下游NF-κB的活化、減輕腎功能衰竭小鼠腎臟及全身的炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的，與Zhou等［19］的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步對小鼠糞便進(jìn)行qPCR結(jié)果顯示，APS組益生菌（雙歧桿菌、乳酸桿菌）的基因表達(dá)量較模型組升高，而機(jī)會(huì)致病菌（大腸桿菌）的基因表達(dá)量明顯下降，提示菌群環(huán)境亦得到改善，這與Dong等［11］以APS治療腹瀉小鼠的糞便菌群檢測結(jié)果一致。為進(jìn)一步探究APS對不同菌群的干預(yù)作用，后續(xù)研究還可將APS單味藥治療的慢性腎功能衰竭模型小鼠糞便進(jìn)行包括宏基因組學(xué)在內(nèi)的深度測序分析。

綜上，APS能通過維持腸道微生態(tài)對慢性腎功能衰竭小鼠的腎臟起保護(hù)作用。其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù)腸道的正常生理功能，下調(diào)lncRNA Arid2-IR表達(dá)以減輕NF-κB磷酸化誘導(dǎo)的系統(tǒng)微炎癥狀態(tài)，修復(fù)腸道黏膜損傷，恢復(fù)腸道屏障功能的保護(hù)作用，減輕腎臟負(fù)擔(dān)，從而改善腎臟損傷。本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用APS及黃芪治療CKD患者，延緩其疾病進(jìn)展提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。