扶腎方對(duì)尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜超濾功能及VEGF-Notch信號(hào)通路的影響

楊波，王孟孟，孫林，鐘柯，李潔，楊洪濤△

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）患者主要的替代治療方式之一，其有效性取決于腹膜功能的完整性。由于使用含葡萄糖腹膜透析液，長(zhǎng)期PD可致腹膜超濾功能逐漸下降，直至衰竭，最終迫使患者退出PD治療［1］。因此，明確腹膜超濾衰竭的具體機(jī)制，對(duì)于提高PD效能具有重要意義。研究表明，腹膜血管新生是引起超濾功能衰竭的重要原因之一［2］。中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)調(diào)控的優(yōu)勢(shì)，在抑制腹膜血管新生和防治超濾衰竭方面應(yīng)用前景良好［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，扶腎方（院內(nèi)制劑：津藥制字Z20130941）可改善尿毒癥腹膜透析大鼠超濾功能，這一作用是否與抑制腹膜血管新生有關(guān)尚不明確。本研究通過利用5/6腎切除尿毒癥大鼠PD模型，探討扶腎方對(duì)尿毒癥PD大鼠腹膜超濾功能及腹膜組織Notch1、Delta-樣配體4（delta-like ligand 4，Dll4）、Notch胞內(nèi)域（intracellular domain of Notch，NICD）、Hes1（hairy and enhancer of split homolog-1，Hes1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vscular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的影響，以期為扶腎方防治PD超濾衰竭提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取50只SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，自由飲水?dāng)z食。大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 扶腎方：黃芪15 g、淫羊藿15 g、陳皮10 g、半夏15 g、當(dāng)歸10 g、丹參30 g、鬼箭羽30 g、熟軍10 g。上述中藥飲片購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。塞來昔布購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司（批號(hào)：J20140072）。1.5%雙聯(lián)腹膜透析液（批號(hào)：G19121675）、4.25%雙聯(lián)腹膜透析液（批號(hào)：G18082462）均購(gòu)自廣州百特醫(yī)療用品有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器DNA/RNA蛋白質(zhì)共提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量預(yù)混試劑（北京天根生化科技有限公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、10×TBST緩沖液、180彩虹廣譜蛋白Marker、ECL超敏發(fā)光液（北京索萊寶科技有限公司），Notch1、NICD兔多克隆抗體（美國(guó)CST公司），Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR2、p-VEGFR2兔多克隆抗體，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）及內(nèi)參GAPDH（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），多功能酶標(biāo)儀、超微量核酸蛋白測(cè)定儀（德國(guó)Thermo），電泳儀、快速轉(zhuǎn)膜儀、顯影儀（美國(guó)Bio-Rad），微量移液器、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀（德國(guó)Eppendorf），-80℃超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)表法分為正常組、模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組、塞來昔布組，每組10只。模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組、塞來昔布組大鼠行5/6腎臟切除術(shù)建立尿毒癥模型，大鼠血肌酐較正常組上升2～3倍，提示尿毒癥造模成功［4］。造模成功后，以大鼠右下腹靠近腹股溝中點(diǎn)為腹腔注射部位，按每日100 mL/kg，腹腔注射1.5%腹膜透析液，腹腔內(nèi)保留，不再抽出，注射4周。正常組予以每日生理鹽水2 mL灌胃，連續(xù)4周。

1.2.2 扶腎方制備 扶腎方藥劑經(jīng)過提取、分離、濃縮、干燥及制粒而成。扶腎方顆粒成人服用劑量為每次18 g，每日2次，根據(jù)人和大鼠體表面積折算（折算系數(shù)為0.018）得出大鼠等效劑量為0.324 g，每日2次。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)給藥 扶腎方低劑量組每日扶腎方324 g/L，2 mL灌胃；扶腎方高劑量組每日扶腎方648 g/L，2 mL灌胃；塞來昔布組每日塞來昔布溶液1.8 g/L，2 mL灌胃；正常組和模型組每日生理鹽水2 mL灌胃。每組均連續(xù)灌胃4周。

1.2.4 腹膜超濾功能檢測(cè) 各組大鼠規(guī)律腹腔注射1.5%腹膜透析液4周末，行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠腹膜超濾功能。腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液25 mL，4 h后用5%水合氯醛（6 mL/kg體質(zhì)量）麻醉大鼠，先抽吸腹腔液體計(jì)量，再打開腹腔，收集腹腔內(nèi)未抽凈的液體并計(jì)量。超濾量=（紗布吸水后的質(zhì)量-紗布的質(zhì)量）×1 mL/g+腹腔抽吸量-腹腔注射量。

1.2.5 標(biāo)本留取及血肌酐的檢測(cè)5/6腎切除4周后，從大鼠眶后靜脈叢取血，應(yīng)用7100型日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐（酶法）。規(guī)律腹腔注射腹膜透析液4周，腹膜平衡實(shí)驗(yàn)計(jì)算超濾量后脊椎脫臼法處死大鼠，大鼠仰臥位固定于鼠板，沿腹白線剪開腹壁，于冰盤上取出腹膜組織，一部分于液氮中保存用于qPCR、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，其余部分于10%福爾馬林中固定用于HE染色。

1.2.6 HE染色觀察腹膜形態(tài)學(xué)變化 取大鼠腹膜組織，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片后，行HE染色，光鏡下觀察大鼠腹膜形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 qPCR檢測(cè)Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGF的mRNA水平 按試劑盒說明書從每組腹膜組織中提取總RNA，測(cè)定提取RNA純度，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL，cDNA模板1.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.5 μL，加ddH2O至總體系25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火32 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。每組選取6個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白印跡法檢測(cè)Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGF、VEGFR-2、p-VEGFR-2蛋白的表達(dá) 取腹膜組織150 mg標(biāo)本加入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液，冰浴超聲20 min，4℃下12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白質(zhì)加入到4×上樣緩沖液中并在95℃下煮沸10 min。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)并印跡到活化的聚偏二氟乙烯膜上。封閉后，將膜與一抗GAPDH（1∶3 000）、Notch1（1∶500）、Dll4（1∶500）、NICD（1∶1 000）、Hes1（1∶1 000）、VEGFR-2（1∶1 000）、p-VEGFR-2（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）在4℃溫育過夜。緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫下孵育帶有HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）1.5 h，緩沖液洗膜3次，每次10 min。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行帶灰度分析。將目標(biāo)帶與參考帶的灰度比值作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平，采用Image J v2.1.4.7軟件進(jìn)行圖片處理。每組抽取6個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Tab.1 Primer sequences of qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，以Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；組間多重比較，方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Games-Howell檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿毒癥模型一般情況 造模過程中大鼠死于腎切除術(shù)后失血1只，死于感染3只，余36只5/6腎切除大鼠血肌酐水平（77.04±9.11）μmol/L明顯高于正常組（28.74±3.73）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=161.180，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腹膜超濾量比較 正常組、模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組及塞來昔布組大鼠腹膜超濾量分別為（3.83±0.57）mL、（-19.01±1.04）mL、（-18.66±0.99）mL、（-14.95±1.59）mL和（-17.38±1.67）mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=719.906，P＜0.05）；與正常組比較，模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組及塞來昔布組大鼠腹膜超濾量明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，扶腎方低劑量組腹膜超濾量無明顯變化（P＞0.05），扶腎方高劑量組與塞來昔布組超濾量明顯增加（P＜0.05）；與扶腎方低劑量組比較，扶腎方高劑量組和塞來昔布組超濾量增加（P＜0.05）；與扶腎方高劑量組比較，塞來昔布組超濾量明顯下降（P＜0.05）。

2.3各組大鼠腹膜組織HE染色 正常組大鼠腹膜組織較連續(xù)和完整，腹膜間皮細(xì)胞呈扁平狀態(tài)，腹膜厚度較??；模型組腹膜組織明顯增厚，部分間皮呈柱形，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見較多新生的小血管，伴有結(jié)締組織的增生。扶腎方低劑量組、高劑量組腹膜厚度介于正常對(duì)照組和模型組之間，血管新生較模型組減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，可見明顯血管淤血；塞來昔布組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腹膜增厚較模型組減輕，與扶腎方高劑量組病理變化相當(dāng)。見圖1。

Fig.1 HE staining of peritoneal tissues of rats in the five groups(left×100,right×200)圖1各組大鼠腹膜組織HE染色（左×100，右×200）

2.4 各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGFmRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1mRNA表達(dá)下調(diào)，VEGFR-2、VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)；扶腎方低劑量組Notch1、NICDmRNA表達(dá)下調(diào)，VEGFR-2、VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)；扶腎方高劑量組VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)；塞來昔布組Dll4、Hes1mRNA表達(dá)下調(diào)，VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，扶腎方低劑量組NICD、Hes1mRNA表達(dá)上調(diào)，VEGFR-2、VEGFmRNA表達(dá)下調(diào)；扶腎方高劑量組Notch1、Dll4、NICD、Hes1mRNA表達(dá)上調(diào)，VEGFR-2、VEGFmRNA表 達(dá) 下 調(diào) ；塞 來 昔 布 組Notch1mRNA表達(dá)上調(diào)，VEGFR-2、VEGFmRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。與扶腎方低劑量組比較，扶腎方高劑量組Notch1、Dll4、VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)，塞來昔布組Notch1mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。與扶腎方高劑量組比較，塞來昔布組Dll4mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2 and VEGF mRNA in peritoneal tissue of rats between the five groups表2各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGF mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2 and VEGF mRNA in peritoneal tissue of rats between the five groups表2各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGF mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

＊P＜0.05；a與正常組比較，b與模型組比較，c與扶腎方低劑量組比較，d與扶腎方高劑量組比較，P＜0.05

組別nNotch1Dll4NICD正常組101.01±0.191.05±0.231.00±0.07模型組90.64±0.15a0.40±0.29a0.46±0.14a扶腎方低劑量組90.63±0.07a0.73±0.140.87±0.11ab扶腎方高劑量組91.12±0.29bc1.47±0.30bc1.06±0.37b塞來昔布組91.41±0.33bc0.61±0.14ad0.67±0.26 F 6.348＊10.949＊4.073＊組別Hes1VEGFR-2VEGF正常組1.01±0.141.04±0.351.01±0.30模型組0.60±0.20a7.93±2.25a10.03±2.15a扶腎方低劑量組1.60±0.57b2.59±0.49ab2.56±0.79ab扶腎方高劑量組1.30±0.38b2.70±1.41b5.59±1.46abc塞來昔布組0.75±0.10a3.07±1.17b3.71±0.38ab F 4.994＊12.704＊27.270＊

2.5 各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)水平的比較 與正常組比較，模型組Notch1、Dll4、NICD、Hes1蛋白表達(dá)下調(diào)，VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)上調(diào)，扶腎方低劑量組Hes1蛋白表達(dá)下調(diào)，扶腎方高劑量組與塞來昔布組NICD蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，扶腎方低劑量組Notch1、Dll4、NICD、Hes1蛋白表達(dá)上調(diào)，VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)，扶腎方高劑量組Dll4、Hes1蛋白表達(dá)上調(diào)，VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)，塞來昔布組Notch1、Dll4蛋白表達(dá)上調(diào)，p-VEGFR-2、VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。見表3、圖2。

Tab.3 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2,p-VEGFR-2 and VEGF protein in peritoneal tissue of rats between the five groups表3各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2,p-VEGFR-2 and VEGF protein in peritoneal tissue of rats between the five groups表3各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

＊P＜0.05；a與正常組比較，b與模型組比較，c與扶腎方低劑量組比較，d與扶腎方高劑量組比較，P＜0.05

組別nNotch1Dll4NICDHes1VEGFR-2p-VEGFR-2VEGF正常組101.04±0.431.20±0.441.32±0.211.63±0.120.86±0.240.48±0.060.93±0.28模型組90.42±0.15a0.57±0.19a0.98±0.02a0.30±0.17a2.64±0.83a0.92±0.45a1.51±0.60a扶腎方低劑量組90.97±0.37b0.86±0.37b1.19±0.11b1.25±0.20ab1.36±0.19b0.42±0.30b0.81±0.27b扶腎方高劑量組90.71±0.440.90±0.27b1.07±0.16a1.43±0.16b1.42±0.49b0.42±0.20b0.93±0.27b塞來昔布組90.78±0.37b0.97±0.21b1.05±0.26a0.93±0.491.25±0.77b0.47±0.22b0.78±0.30b F 3.244＊4.252＊5.444＊14.310＊4.234＊6.633＊4.090＊

Fig.2 The expressions of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2,p-VEGFR-2 and VEGF protein in peritoneal tissue of rats between the five groups圖2各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)

3 討論

目前，全球接受PD治療的患者超過272 000例［5］。截至2017年底，我國(guó)PD患者為86 264例［6］。腹膜超濾功能衰竭發(fā)生的原因和機(jī)制復(fù)雜，其中腹膜血管新生起到了重要作用。抑制腹膜血管新生較抑制腹膜纖維化更能保護(hù)腹膜功能［7］。目前，臨床主要采用改進(jìn)PD技術(shù)、預(yù)防PD相關(guān)腹膜炎、改善腹膜透析液的生物相容性等手段抑制PD相關(guān)腹膜血管新生，改善腹膜超濾功能，延緩超濾衰竭。近年有研究表明，部分單味及中藥復(fù)方具有抑制腹膜血管新生、抗腹膜纖維化的作用，如丹參酮、黃芪甲苷、腎康注射液等可改善由含葡萄糖腹膜透析液誘導(dǎo)的大鼠腹膜功能減退，防治腹膜纖維化［8］。中醫(yī)藥在抑制PD相關(guān)腹膜血管新生，防治超濾衰竭中的作用越來越受到關(guān)注。

血管新生是在原有血管基礎(chǔ)上，通過出芽或套疊增生而形成，該過程不僅與機(jī)體的正常發(fā)育和組織修復(fù)等密切相關(guān)，也參與腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等病變的發(fā)生與發(fā)展［9］。血管新生受VEGF及其受體VEGFR-2調(diào)控［10］，Notch通路也參與了血管形成的一系列過程，可直接影響尖端細(xì)胞的分化、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管穩(wěn)定性以及動(dòng)靜脈分化等。VEGFNotch通路可影響血管新生過程的多個(gè)環(huán)節(jié)，可通過調(diào)控VEGF-Notch信號(hào)通路的不同作用靶點(diǎn)，達(dá)到調(diào)控血管新生的目的［11］。Notch信號(hào)通路是一條高度保守的經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖分化、組織和器官的發(fā)育等［12］。在哺乳動(dòng)物中，Notch通路由Notch受體、Notch配體以及下游分子等組成。Notch受體共4個(gè)，包括Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。Notch配體有5個(gè)，包括Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1及Jagged2。Notch1受體表達(dá)于柄細(xì)胞，主要參與血管新生及血管正常生長(zhǎng)。Dll4在尖端細(xì)胞表達(dá)，其表達(dá)過度或者減少，都會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能。Notch1與Dll4配體結(jié)合，抑制VEGF誘導(dǎo)柄細(xì)胞轉(zhuǎn)化為尖端細(xì)胞，上調(diào)Dll4表達(dá)，可影響Notch信號(hào)通路，防止內(nèi)皮細(xì)胞過度出芽，使血管適度生長(zhǎng)，從而維持血管有序發(fā)生及生長(zhǎng)，保證新生血管的管腔形成，促使血管功能性成熟，從而達(dá)到調(diào)控血管新生的目的。而阻斷Notch信號(hào)通路能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細(xì)胞的過度增殖，產(chǎn)生大量無功能的新生血管，使血管灌注減少［13］。NICD是Notch的活性形式，NICD的表達(dá)可促進(jìn)Notch信號(hào)通路的活化，Hes1是Notch信號(hào)通路重要的下游靶分子［14］。研究發(fā)現(xiàn)，Hes1的表達(dá)與Notch1高表達(dá)呈正相關(guān)，而Notch1的活性表現(xiàn)形式為NICD，說明NICD與Hes1的表達(dá)也具有一致性［15］。

有序的血管形成需要VEGF與Notch信號(hào)通路協(xié)調(diào)作用，VEGF包括不同的分子亞型和不同的VEGF結(jié)合受體，其中VEGFR-2與血管新生的關(guān)系最為密切［16］。Dll4是VEGF的下游分子，VEGF與其受體VEGFR-2結(jié)合后可引起Dll4高表達(dá)，過表達(dá)的Dll4與Notch受體結(jié)合，激活Notch信號(hào)通路。同時(shí)，Dll4可以通過對(duì)VEGF的負(fù)反饋來抑制其受體VEGFR-2的表達(dá)以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，減少血管的過度生長(zhǎng)［17］。塞來昔布是環(huán)氧化酶2抑制劑，可以抑制尿毒癥PD大鼠腹膜血管新生，改善腹膜超濾功能，已在實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛應(yīng)用［18］。本課題組前期研究表明，扶腎方可通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子表達(dá)，抑制腹膜間皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善腹膜功能及腹膜纖維化［19］。VEGF-Notch信號(hào)通路與PD相關(guān)腹膜血管新生及腹膜超濾衰竭的關(guān)系鮮見研究報(bào)道。

本研究通過建立5/6腎切除大鼠慢性腎衰竭模型，腹腔注射含葡萄糖腹膜透析液，成功復(fù)制尿毒癥大鼠PD模型，觀察扶腎方對(duì)尿毒癥PD大鼠腹膜超濾功能及腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGF、VEGFR-2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，模型組及各干預(yù)組大鼠腹膜超濾量明顯低于正常組，扶腎方高劑量組與塞來昔布組超濾量高于模型組和扶腎方低劑量組，塞來昔布組超濾量低于扶腎方高劑量組，提示扶腎方可改善腹膜超濾功能。腹膜HE染色顯示，扶腎方低劑量組與高劑量組大鼠腹膜新生血管較模型組明顯減少。與正常組比較，模型組大鼠腹膜組織Notch1、NICD、Dll4、Hes1的mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào) ，VEGFR-2、VEGFmRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)上調(diào)。與模型組比較，扶腎方低劑量組NICD、Hes1mRNA及Notch1、NICD、Dll4、Hes1蛋白表達(dá)上調(diào)，扶腎方高劑量組Notch1、NICD、Dll4、Hes1mRNA及Dll4、Hes1蛋白表達(dá)上調(diào)，塞來昔布組Notch1mRNA及Notch1、Dll4蛋白表達(dá)上 調(diào) ，各 干 預(yù) 組VEGFR-2、VEGFmRNA及p-VEGFR2、VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)均下調(diào)。以上結(jié)果表明扶腎方的作用與塞來昔布類似。筆者推測(cè)在5/6腎切除尿毒癥大鼠PD模型中，扶腎方通過上調(diào)腹膜組織Notch1、NICD、Dll4、Hes1的mRNA及蛋白表達(dá)，下調(diào)VEGFR-2、VEGFmRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)，抑制腹膜血管新生，達(dá)到改善腹膜超濾功能，防治超濾衰竭的作用。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，尿毒癥為本虛標(biāo)實(shí)證，本虛多為脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)以濕濁、瘀血為主，濁、瘀是脾腎虧虛產(chǎn)生的病理因素，又是誘導(dǎo)加重脾腎虧虛的主因。ESRD患者行PD治療后，尿毒癥病機(jī)關(guān)鍵未變，故PD相關(guān)腹膜超濾衰竭的主要病機(jī)仍為脾腎虧虛、濕濁瘀血內(nèi)蘊(yùn)。扶腎方正是據(jù)此病機(jī)關(guān)鍵組成的臨床效方，由陳皮、半夏、當(dāng)歸、黃芪、淫羊藿、丹參、熟軍、鬼箭羽組成，治法融“補(bǔ)、消、和”于一體，效專“健脾益腎，化瘀降濁”。既往臨床及基礎(chǔ)研究表明，扶腎方可顯著延緩尿毒癥PD大鼠腹膜纖維化，改善腹膜超濾衰竭［19-20］，但該作用與腹膜血管新生的關(guān)系目前尚不明確。

綜上所述，本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，扶腎方可通過上調(diào)腹膜組織Notch1、NICD、Dll4、Hes1的mRNA及蛋白表達(dá)，下調(diào)VEGFR-2、VEGFmRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)，抑制腹膜血管新生，防治腹膜超濾衰竭，為臨床應(yīng)用扶腎方防治腹膜超濾衰竭提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支持。但扶腎方抑制腹膜血管新生，防治腹膜超濾衰竭是否還通過其他信號(hào)通路發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步深入探索。