PCSK9抑制劑在ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷中的保護(hù)作用研究

許景涵，左俊榮，韓楚儀，李婷婷，金冬霞，趙福梅，叢洪良△

動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈疾病和腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。在動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上，急性血栓形成導(dǎo)致血管閉塞引起的心肌梗死和腦卒中是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的死亡原因［1-2］。動(dòng)脈粥樣硬化由多種因素引起，其確切發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）可通過(guò)血凝素低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）調(diào)控表面黏附分子表達(dá)，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，加速內(nèi)皮損傷，形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾?。?-5］。

人類枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9（PCSK9）是原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin家族的成員，編碼神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化酶1，與家族性常染色體顯性高膽固醇血癥有關(guān)［6］。PCSK9可通過(guò)降低肝細(xì)胞上低密度脂蛋白受體（LDLR）的數(shù)量，升高低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，導(dǎo)致高膽固醇血癥［7-8］。有研究證實(shí)PCSK9抑制劑可通過(guò)降低脂蛋白a水平來(lái)降低靜脈血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［9］。其還可阻斷LDLR，降低LDL-C水平，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。但是否還具有抗炎、減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、改善血管內(nèi)皮的功能，目前尚不完全明確。本研究采用ox-LDL處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）建立細(xì)胞損傷模型，予以不同濃度PCSK9抑制劑處理，旨在探討PCSK9抑制劑對(duì)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料HUVECs細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司。胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Meilunbio公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit（RR037A）、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（RR820L）、RNAiso Plus（9109）均購(gòu)自日本TaKaRa公司。ECL發(fā)光液（B500014）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。PCSK9抗體（ab181142）購(gòu) 自英國(guó)Abcam公 司，Bax抗體（YM3619）、Bcl-2抗體（YM3041）、Cleaved-Caspase-3抗體（YM3431）和GAPDH抗體（YM3215）均購(gòu)自北京Immunoway公司。核因子（NF）-κB抗體（ABP51957）和磷酸化NF-κB（p-NF-κB）抗體（ABP50369）均購(gòu)自Abbkine公司。IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ox-LDL（H7980）、胞漿蛋白和核蛋白提取試劑盒均購(gòu)自北京Solarbio公司，PCSK9抑制劑（S7976）購(gòu)自selleck公司。白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α和單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒均購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組HUVECs置于含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)并于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育；然后使用0.3%的胰酶消化并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分為Control組（僅更換培養(yǎng)基），ox-LDL組（50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)24 h），低、中、高劑量PCSK9抑制劑組（分別用5、10、20 μmol/L PCSK9抑制劑預(yù)處理24 h，再加入50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)24 h），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 細(xì)胞分組處理24 h后，每孔加入新鮮配制的含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm的光密度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞存活率＝（實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100%，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)存活率曲線。

1.2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α和MCP-1的含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α和MCP-1的含量。

1.2.4 qPCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-6、TNF-α和MCP-1的轉(zhuǎn)錄水平 收集各組處理好的細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌3次，加入1 mL Trizol裂解液提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR體系：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX reference Dye 0.4 μL，滅菌水6 μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取處理好的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化。500×g離心5 min，棄上清液，細(xì)胞收集到管底；結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。取100 μL細(xì)胞懸液（約1×105個(gè)細(xì)胞），加入5 μL Annexin V和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。孵育完成后，每管加入400 μL結(jié)合緩沖液，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（1 h內(nèi)檢測(cè)完畢）。

1.2.6 Western blot檢 測(cè)Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、PCSK9、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá) 收集處理好的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。根據(jù)胞漿蛋白和核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行胞漿蛋白、核蛋白提取。采用BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中蛋白濃度，統(tǒng)一上樣30 μg進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳條件：80 V 30 min，然后120 V 2 h。電泳結(jié)束后17 V恒壓轉(zhuǎn)膜30 min，之后室溫5%脫脂牛奶封閉3 h，TBST洗膜后添加Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、PCSK9、NF-κB、p-NF-κB和GAPDH一抗（均為1∶1 000稀釋）于4℃孵育過(guò)夜；次日TBST洗膜3次，加入二抗（1∶10 000稀釋），室溫孵育2 h后TBST洗膜3次。在暗室中使用ECL顯影曝光，掃描軟件進(jìn)行圖像采集，Image J軟件分析灰度值并計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較時(shí)方差齊行LSD-t法，方差不齊行Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 與Control組比較，ox-LDL組HUVECs存活率明顯下降；與ox-LDL組相比，中、高劑量PCSK9抑制劑處理后，HUVECs存活率升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 各組細(xì)胞TNF-α、IL-6和MCP-1轉(zhuǎn)錄及分泌水平變化 與Control組比較，ox-LDL組細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6和MCP-1轉(zhuǎn)錄及分泌水平增加（P＜0.05）。與ox-LDL組相比，中、高劑量PCSK9抑制劑處理細(xì)胞IL-6、TNF-α和MCP-1轉(zhuǎn)錄及分泌水平明顯下降，低劑量組IL-6和MCP-1轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，見(jiàn)表2。

Fig.1 Changes of cell activity in each group圖1各組細(xì)胞存活率變化

2.3 各組細(xì)胞凋亡水平比較Control組，ox-LDL組，低、中、高劑量PCSK9抑制劑組細(xì)胞凋亡率分別為（3.07±0.91）%、（34.25±3.19）%、（23.80±2.84）%、（15.67±2.25）%、（8.93±1.62）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.560，P＜0.01）。與Control組比較，ox-LDL組中細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，PCSK9抑制劑處理的細(xì)胞凋亡率均降低，中、高劑量PCSK9抑制劑組凋亡率降低更為明顯（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化 與Control組 比 較，ox-LDL組 細(xì) 胞 促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，p-NF-κB水平升高（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，中、高劑量PCSK9抑制劑處理后，Bax和Cleaved-Caspase-3表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，同時(shí)p-NF-κB水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

2.5 各組細(xì)胞核及胞質(zhì)中NF-κB表達(dá)變化 與Control組比較，ox-LDL組細(xì)胞核中NF-κB表達(dá)上調(diào)，胞質(zhì)中表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，中、高劑量PCSK9抑制劑處理后，HUVECs細(xì)胞質(zhì)中NF-κB表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞核NF-κB表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖4。

Tab.2 Changes of TNF-α,IL-6 and MCP-1 proteins and their gene levels in each group表2各組細(xì)胞中TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白及其基因水平變化 （n=3，±s）

Tab.2 Changes of TNF-α,IL-6 and MCP-1 proteins and their gene levels in each group表2各組細(xì)胞中TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白及其基因水平變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與ox-LDL組比較，c與低劑量PCSK9抑制劑組比較，d與中劑量PCSK9抑制劑組比較，P＜0.05；表3、4同

組別TNF-αIL-6MCP-1基因 蛋白（ng/L） 基因 蛋白（ng/L） 基因 蛋白（ng/L）Control組1.03±0.2256.65±2.111.06±0.3516.59±2.061.05±0.36149.67±4.39 ox-LDL組9.29±1.20a93.21±8.02a4.91±0.59a34.65±3.44a17.21±1.52a272.81±15.10a低劑量PCSK9抑制劑組8.26±1.00a88.87±8.65a3.15±0.42ab31.50±2.64a7.63±1.73ab238.99±10.93a中劑量PCSK9抑制劑組4.57±1.55abc72.24±6.80ab2.54±0.45ab28.39±2.14ab6.29±0.46ab226.66±7.95ab高劑量PCSK9抑制劑組3.88±1.77abc67.03±9.14abc2.16±1.10bc22.82±2.13ab2.80±0.60bcd207.26±4.77abc F 14.160＊＊119.419＊＊9.760＊＊111.619＊＊65.989＊＊142.917＊＊

Fig.2 Changes of apoptosis levels in each group圖2各組細(xì)胞凋亡水平變化

Tab.3 The changes of the expressions of apoptosis-related proteins and p-NF-κB in each group表3各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及p-NF-κB表達(dá)變化 （n=3，±s）

Tab.3 The changes of the expressions of apoptosis-related proteins and p-NF-κB in each group表3各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及p-NF-κB表達(dá)變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別BaxBcl-2Cleaved-Caspase-3PCSK9p-NF-κB/NF-κB Control組0.52±0.050.64±0.020.17±0.050.26±0.020.47±0.12 ox-LDL組0.85±0.08a0.30±0.05a0.64±0.09a0.59±0.03a1.14±0.08a低劑量PCSK9抑制劑組0.78±0.06a0.33±0.03a0.61±0.07a0.53±0.03a1.03±0.06b中劑量PCSK9抑制劑組0.71±0.07b0.44±0.03ab0.56±0.03ab0.43±0.02ab0.61±0.01abc高劑量PCSK9抑制劑組0.56±0.07bc0.67±0.08bcd0.36±0.04abcd0.27±0.01bcd0.57±0.03abc F 8.881＊＊24.127＊＊20.362＊＊73.227＊＊58.210＊＊

Fig.3 Results of Western blot detection of apoptosis-related protein expression level in HUVECs圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

Tab.4 The changes of the expressions of NF-κB in nucleus and cytoplasm in each group表4各組細(xì)胞核及胞質(zhì)中NF-κB表達(dá)變化（n=3，±s）

Tab.4 The changes of the expressions of NF-κB in nucleus and cytoplasm in each group表4各組細(xì)胞核及胞質(zhì)中NF-κB表達(dá)變化（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別 細(xì)胞核 細(xì)胞質(zhì)NF-κB/Histone H3NF-κB/GAPDH Control組0.44±0.031.07±0.06 ox-LDL組1.09±0.11a0.40±0.03a低劑量PCSK9抑制劑組0.91±0.02a0.76±0.02ab中劑量PCSK9抑制劑組0.79±0.10abc0.88±0.08b高劑量PCSK9抑制劑組0.74±0.05abc1.16±0.12bcd F 23.383＊＊34.107＊＊

Fig.4 The protein expression levels of NF-κB in cytoplasm and nucleus of each group detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中NF-κB蛋白表達(dá)水平

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要誘發(fā)因素。內(nèi)皮細(xì)胞損傷常伴隨炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)直接影響中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，誘發(fā)炎性因子募集，進(jìn)而加劇內(nèi)皮損傷。

PCSK9不僅參與脂代謝，還與細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。無(wú)內(nèi)毒素的重組PCSK9可使促炎性因子（如IL-1β、TNF-α、MCP-1和IL-6）在初級(jí)巨噬細(xì)胞和THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)增加［10］。此外，PCSK9還可激活TLR4/NF-κB通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血后PCSK9表達(dá)上調(diào)，激活自噬，增加心肌梗死面積，降低心功能，提示PCSK9過(guò)表達(dá)可能是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制之一［11］。在載脂蛋白E基因敲除（apoEKO）小鼠中發(fā)現(xiàn)，沉默PCSK9表達(dá)可通過(guò)減輕血管炎癥反應(yīng)和抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路直接抑制動(dòng)脈粥樣硬化［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL處理的HUVECs中TNF-α、IL-6和MCP-1等炎性因子均明顯增加，表明ox-LDL可使內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)加劇，而經(jīng)10、20 μmol/L的PCSK9抑制劑干預(yù)后炎性因子的轉(zhuǎn)錄和分泌水平明顯下降，提示PCSK9抑制劑可以減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。

隨著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡能夠損傷內(nèi)皮的完整性并增加通透性，誘發(fā)血管損傷和斑塊形成。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL處理后的HUVECs細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞凋亡增加。PCSK9抑制劑干預(yù)后，明顯逆轉(zhuǎn)ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細(xì)胞存活率降低，減少細(xì)胞凋亡。研究表明，下調(diào)PCSK9表達(dá)抑制HUVECs的凋亡主要通過(guò)Bcl/Bax-Caspase9-Caspase3線 粒 體 凋 亡 通 路［13］。PCSK9Qβ-003疫苗通過(guò)調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和凋亡來(lái)減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［14］。本研究結(jié)果顯示PCSK9抑制劑可以明顯下調(diào)Cleaved-Caspase-3表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)。另有研究表明PCSK9通過(guò)損傷線粒體DNA加重Caspase-1依賴的細(xì)胞凋亡，促炎因子和凋亡可能是治療PCSK9相關(guān)心血管疾病的潛在靶點(diǎn)［15］。此外，筆者發(fā)現(xiàn)PCSK9抑制劑通過(guò)影響NF-κB入核發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，抑制細(xì)胞凋亡，但其具體深入的核內(nèi)調(diào)控機(jī)制目前還在探索中。

綜上所述，本研究初步證實(shí)PCSK9抑制劑可抑制ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞活性；但這些效果是否獨(dú)立于降脂作用尚不完全清楚。PCSK9抑制劑作為新型降脂藥在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其機(jī)制尚需更多的基礎(chǔ)及臨床研究來(lái)揭示，進(jìn)而為臨床防治心血管疾病提供更加充分的理論依據(jù)。