番茄Trihelix家族SIP1亞家族基因（SlGT-33）克隆表達(dá)分析及功能研究

崔寶祿 陳國平

崔寶祿（1979-），副教授，主要從事番茄分子生物學(xué)研究工作。先后主持國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目“黃單胞菌效應(yīng)因子AvrBS3靶基因SlUPA-like調(diào)控植物畸形發(fā)育的機(jī)理研究”、貴州省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目“番茄SlUPA-like基因提高防御黃單胞桿菌病害的研究”、貴州省拔尖人才項(xiàng)目“番茄Trihelix轉(zhuǎn)錄因子GT-2亞家族SlGTL5基因應(yīng)答非生物脅迫的分子機(jī)制研究”、貴州省農(nóng)業(yè)重大產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目“校農(nóng)結(jié)合扶貧點(diǎn)蔬菜立體栽培與采后處理技術(shù)示范”等科研項(xiàng)目10余項(xiàng);申報(bào)國家專利10項(xiàng)，已授權(quán)發(fā)明專利1項(xiàng)，實(shí)用新型專利3項(xiàng);以第一作者或通訊作者在《Scientific Reports》《Plant Physiology & Biochemistry》《Crop Science》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《西北植物學(xué)報(bào)》《分子植物育種》等期刊上發(fā)表科技論文10余篇。

摘要：【目的】對(duì)番茄三螺旋（Trihelix）家族SIP1亞家族基因（SlGT-33）進(jìn)行克隆表達(dá)及功能研究，為深入解析SIP1亞家族成員調(diào)控植物生長發(fā)育機(jī)制及選育矮化番茄品種提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳苑哑贩NAC++為材料，PCR擴(kuò)增SlGT-33基因，對(duì)其進(jìn)行序列分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)SlGT-33基因在不同組織及外源激素和非生物脅迫下的表達(dá)模式，并利用RNAi技術(shù)鑒定SlGT-33基因的生物學(xué)功能。【結(jié)果】擴(kuò)增獲得的SlGT-33基因（GenBank登錄號(hào)Solyc12g043090）開放閱讀框（ORF）為1125 bp，編碼374個(gè)氨基酸殘基，與已知同源基因序列（GenBank登錄號(hào)XP004252336.1）僅缺少3個(gè)堿基。SlGT-33與SlGT-17（GenBank登錄號(hào)Solyc05g018350）位于同一分支，雖然二者的氨基酸序列相似性最高，但僅為45.8%。SlGT-33基因在莖和成熟葉中的相對(duì)表達(dá)量較高，顯著高于其他組織（P<0.05，下同）;經(jīng)IAA、GA3和MeJA處理后，SlGT-33基因的相對(duì)表達(dá)量均與對(duì)照無顯著差異（P>0.05，下同）;SlGT-33基因經(jīng)ABA處理2～24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。SlGT-33基因在高鹽脅迫和機(jī)械損傷下的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異;高溫脅迫和低溫脅迫下SlGT-33基因表達(dá)整體上均呈逐漸降低的變化趨勢(shì);在脫水脅迫下SlGT-33基因表達(dá)整體上均呈逐漸升高的變化趨勢(shì)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得6個(gè)SlGT-33-RNAi沉默株系，沉默效率為64%～83%。生長70 d的SlGT-33-RNAi沉默株系RNAi-4和RNAi-5幼苗株高和節(jié)間長度均為野生型的60%左右，且復(fù)葉結(jié)構(gòu)尺寸明顯變小，花序提前形成。莖尖組織中頂端分生組織關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因KNOX2和WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系的相對(duì)表達(dá)量均極顯著（P<0.01）或顯著高于野生型，腺苷酸異戊烯轉(zhuǎn)移酶（CTK合成的關(guān)鍵酶）編碼基因IPT2和莖尖生長點(diǎn)調(diào)控基因PHAN基因在2個(gè)SlGT-33-RNAi沉默株系的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于野生型。頂端分生組織關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因KNOX1基因在2個(gè)SlGT-33-RNAi沉默株系的相對(duì)表達(dá)量與野生型無顯著差異。SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織的細(xì)胞分裂素（CTK）含量顯著低于野生型?！窘Y(jié)論】SlGT-33基因?qū)儆诃h(huán)境敏感型基因，其表達(dá)受ABA和脫水脅迫誘導(dǎo)，但受極端溫度的抑制。抑制SlGT-33基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致了番茄植株矮化和生殖生長加速，其作用機(jī)制與頂端分生組織的CTK合成受抑制及莖尖組織調(diào)控基因KNOX2、PHAN和WUS的異常表達(dá)密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 番茄;SlGT-33基因;植株矮化;表達(dá)分析;功能研究

中圖分類號(hào)： S641.203.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）04-0857-10

Cloning expression analysis and functions of SIP1 subfamily gene（SlGT-33） in tomato Trihelix family

CUI Bao-lu1， CHEN Guo-ping2

（1The Department of Life Science and Agriculture， Qiannan Normal University for Nationalities， Duyun， Guizhou 558000， China; 2 College of Bioengineering， Chongqing University， Chongqing? 400044， China）

Abstract：【Objective】Cloning expression and function of SIP1 subfamily gene（SlGT-33） of tomato? Trihelix family to provide theoretical basis for analyzing the mechanism of SIP1 subfamily members regulating plant growth and development， and breeding of dwarf tomato varieties. 【Method】Using the tomato variety AC++， amplified its SlGT-33 gene by PCR， performed sequence analysis， and used real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） to detect its expression patterns in different tissues and exogenous hormones and non-biological stress. Finally， the RNAi technique was used to identify the biological function of SlGT-33 gene. 【Result】The length of SlGT-33（GenBank accession number：Solyc12g 043090）open reading frame（ORF） was 1125 bp，encoding 375 amino acids residues， which was short of 3 bp than its homologous gene（GenBank accession number：XP004252336.1）. Phylogenetic analysis suggested that SlGT-33 protein was in the same branch with SlGT-17（GenBank accession number：Solyc05g018350），though the similarity between their amino acids sequence was the highest， the value was only 45.8%. SlGT-33 gene was significantly expressed in stem and mature leaves than other tissues（P<0.05， the same below）. After IAA， GA3， MeJA treatments， the expression of SlGT-33 gene did not differ significantly from control（P>0.05， the same below）. Compared to control，SlGT-33 could be significantly up-regulated by ABA within 2-24 h. SlGT-33 gene expression was not significantly different from control under high salt stress and mechanical damage. The expression of SlGT-33 gene decreased gradually under high temperature stress and low temperature stress，while expression of SlGT-33 gene increased gradually under dehydrationstress. Six SlGT-33-RNAi silent lines were harvested by Agrobacterium-mediated transformation and silence rate varied from 64% to 83%. The plant height and internode length of 70 d SlGT-33-RNAi silent lines decreased to 60% of wild types. The compound leaf structure was significantly smaller and the inflorescence formed in advance. The key transcription factor genes KNOX2 and WUS in stem tip tissue were extremely significantly expressed in the SlGT-33-RNAi silent lines（P<0.01） or significantly higher than the wild type. Adenylate isopentenyl transferase（key enzyme for CTK synthesis） encoded gene IPT2 and the stem tip growth point regulatory gene PHAN were expressed significantly lower in two SlGT-33-RNAi silent linesthan wild type. The expression of the apical biological tissue key transcription factor gene KNOX1 gene was not significantly different compared with in two SlGT-33-RNAi silentlines. Thecytokinin（CTK） of SlGT-33-RNAi silent line stem tip tissue was significantly lower than in the wildtype. 【Conclusion】SlGT-33 gene was sensitive to environment. It can be induced by ABA and dehydration stresses and suppressed by extreme temperature. But suppressed expression of SlGT-33 leads to dwarf plants and accelerating reproductive development，which is related with inhibition of CTK synthesis of apical meristem? and abnormal expressions of stem tip tissue key regulation genes KNOX2， PHAN and WUS.

Key words： tomato; SlGT-33 gene;dwarf plants; expression analysis;? functional study

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960605）;Basic Research Project of Guizhou? Science and Technology Department （〔2018〕1144）;Top-notch Talent Support Project of Guizhou Education Department（Qianjiaohe〔2016〕111）;Major Technical Innovation Project of Qiannan Normal University for Nationalities（QNSY 2018PT001）

0 引言

【研究意義】番茄（Solanum lycopersicom）為多年生草本，在適宜條件下其頂端分生組織可無限生長。合理施用植物生長延緩劑可使植株矮化，抑制頂端無限生長（黃艷花等，2011），但缺乏遺傳穩(wěn)定性。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)番茄矮化基因的功能研究也逐步深入，已發(fā)現(xiàn)番茄基因組可編碼60多種轉(zhuǎn)錄因子，其中三螺旋（Trihelix）轉(zhuǎn)錄因子與植株矮化密切相關(guān)（Kaplan-Levy et al.，2012;Liu et al.，2020），因此研究該家族基因的功能對(duì)揭示植物生長發(fā)育機(jī)制及加速番茄矮化品種選育具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Trihelix轉(zhuǎn)錄因子為植物特有，在植物形態(tài)發(fā)生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用，其調(diào)控機(jī)制為Trihelix結(jié)構(gòu)域（螺旋—環(huán)/轉(zhuǎn)角—螺旋—環(huán)/轉(zhuǎn)角—螺旋）特異結(jié)合下游基因啟動(dòng)子的GT元件，進(jìn)而調(diào)控靶基因表達(dá)（Liu et al.，2020）。Trihelix轉(zhuǎn)錄因子家族分為6個(gè)亞家族：GT-1、GT-2、SH4、SIP1、GT-γ和GT-δ（Kaplan-Levy et al.，2012），各亞家族成員的生物學(xué)功能逐步被鑒定。其中，GT-2亞家族成員的研究較深入，如PTL基因突變后，植株即出現(xiàn)矮化、葉片卷曲、花藥無法開裂等表型（Li et al.，2008），且該基因主要作用于花瓣和萼片等花被器官發(fā)育，尤其對(duì)花器官的著生部位及方向起決定作用（Griffith et al.，1999;Brewer et al.，2004）;GTL1基因調(diào)控毛狀體發(fā)育，該基因突變后，葉片毛狀體的DNA含量增加2～3倍（Breuer et al.，2009）;GT-2基因可響應(yīng)外源激素和非生物脅迫（崔寶祿等，2020）。GT-γ亞家族成員可響應(yīng)鹽、干旱等非生物脅迫，超表達(dá)后可提高植株耐鹽性（Fang et al.，2010）。SIP1亞家族基因的功能研究相對(duì)薄弱。煙草NtSIP1含有Trihelix結(jié)構(gòu)域，可促進(jìn)6b因子的核定位（Kitakura et al.，2002）;擬南芥ASIL1除含有Trihelix結(jié)構(gòu)域外，還含有甘氨酸和脯氨酸富集區(qū)，可結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)，抑制種子成熟（Gao et al.，2009），且ASIL1與ASIL2共同抑制胚胎成熟過程，表現(xiàn)為asil1asil2突變體胚胎中葉綠體和葉綠素的積累均有所增加（Barr et al.，2012）。此外，部分學(xué)者將C末端融合天冬氨酸/谷氨酸/尿苷激酶的Trihelix轉(zhuǎn)錄因子劃入SIP1亞家族，且證實(shí)其功能可能與葉片暗綠、畸形發(fā)育有關(guān);同屬于SIP1亞家族的FRIGIDA-INTERACTING PROTEIN2（FIP2）基因5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）編碼Trihelix結(jié)構(gòu)域，其功能可能與春化誘導(dǎo)開花相關(guān)（Kaplan-Levy et al.，2012）。擬南芥SIP1亞家族蛋白AST1具有調(diào)控氣孔開閉、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞失水死亡等功能（Xu et al.，2018）。綜上所述，SIP1亞家族基因參與植物種子形成、生長發(fā)育、非生物脅迫等過程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】番茄具有基因組小、基因組測(cè)序完整、遺傳轉(zhuǎn)化效率高且穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，但至今鮮見有關(guān)番茄SIP1亞家族基因功能的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以番茄品種AC++為材料，PCR擴(kuò)增其SIPI亞家族基因SlGT-33的開放閱讀框（ORF），對(duì)其進(jìn)行序列分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)SlGT-33基因在不同組織及外源激素和非生物脅迫下的表達(dá)模式，最后利用RNAi技術(shù)鑒定SlGT-33基因的生物學(xué)功能，以期解析其調(diào)控植株矮化的分子機(jī)制，為深入解析SIP1亞家族成員調(diào)控植物生長發(fā)育機(jī)制及選育矮化番茄品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

番茄高度自交品種AC++[S. lycopersicom Mill. cv. Ailsa Craig（AC++）]引自重慶大學(xué)生物工程學(xué)院。高保真酶PrimerStar Max和M-MLV Reverse Transcriptas反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司，細(xì)胞分裂素（CTK）酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Premix Ex Taq II Kit購自Promega公司，其他生化試劑購自重慶凱飛科技有限公司。主要設(shè)備儀器包括ChemDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）及CFX96 Real-time PCR 檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 組織樣品采集 番茄AC++種植于黔南民族師范學(xué)院溫室大棚內(nèi)，光照16 h（27 ℃）和黑暗8 h （19 ℃）。待植株開花結(jié)果后，分別選取成熟植株的根（Root，RT）、莖（Stem，ST）、成熟葉（Mature leaf，ML）、花（Flower，F(xiàn)L）和果皮，其中果皮包括綠色果皮（GF）和紅色果皮（RF），分別取自直徑1 cm的果實(shí)和破色4 d后的果實(shí)。上述材料液氮速凍后置于 -80 ℃冰箱。AC++種子播種于營養(yǎng)缽中，生長35 d后用于外源激素處理和非生物脅迫。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 采取番茄組織樣品用液氮速凍后，采用TRIzol試劑法提取總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA提取質(zhì)量。以提取的總RNA為模板，采用M-MLV Reverse Transcriptas反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用于后續(xù)的基因克隆及表達(dá)分析。

1. 2. 3 SlGT-33基因克隆 利用NCBI和茄科基因組數(shù)據(jù)庫（SGN）的生物信息學(xué)搜索，采用NCBI設(shè)計(jì)引物SlGT-33-all-F和SlGT-33-all-R（表1），以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增SlGT-33基因ORF。反應(yīng)體系（50.0 μL）：2×PrimerStar Max 25.0 μL， cDNA模板1.0 μL，10 mmol/L正、反向引物（SlGT-33-all-F和SlGT-33-all-R）各1.0 μL，去離子水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段，并連接至pMD18-T載體上送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1. 2. 4 生物信息學(xué)分析 在SGN和NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索不同植物SIP1家族蛋白的氨基酸序列。將搜索獲得的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果確定SIP1亞家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域?；诓煌参颯IP1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以預(yù)測(cè)其生物功能。采用MultAlin（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）將cDNA與基因組進(jìn)行序列比對(duì)，利用NCBI數(shù)據(jù)庫的CDD網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)SlGT-33蛋白保守區(qū)。并以ClustalX和DNAMAN 6.0進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用MEGA 10.0.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 5 外源激素處理及非生物脅迫 取生長35 d的番茄幼苗，分別對(duì)其噴施50 μmol/L吲哚乙酸（IAA）、50 μmol/L赤霉素（GA3）、50 μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol/L脫落酸（ABA）和100 μmol/L 1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC），以噴施水為對(duì)照，于0、1、2、4、8、12和24 h后取幼苗中部葉片進(jìn)行液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫╖hu et al.，2014）。設(shè)3次重復(fù)。

AC++種子播種于營養(yǎng)缽中，待生長35 d后獲得番茄幼苗，分別對(duì)其進(jìn)行高鹽（以20 mmol/L NaCl緩慢澆灌到植物根部，直至鹽水從花缽下面流出）、高溫（40 ℃）、低溫（4 ℃）、脫水（在水中緩慢清洗幼苗根系土壤，直至洗脫干凈，置于室溫下自然失水）和機(jī)械損傷（用剪刀剪碎葉片）等非生物脅迫處理，以未處理幼苗為對(duì)照，分別于脅迫0、1、2、4、8、12、24和36 h后選取處理幼苗的中部葉片，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫≒an et al.，2012）。設(shè)3次重復(fù)。

1. 2. 6 基因表達(dá)分析 以cDNA為模板，qRT-PCR檢測(cè)SlGT-33基因在不同組織及非生物脅迫和植物激素處理下的表達(dá)模式，并檢測(cè)SlGT-33基因的下游基因表達(dá)情況 ，包括腺苷酸異戊烯轉(zhuǎn)移酶（CTK合成的關(guān)鍵酶）基因（IPT2）、莖尖生長點(diǎn)調(diào)控基因（PHAN）及頂端分生組織關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因（KNOX1、KNOX2和WUS）。其中，不同組織SlGT-33基因及其下游基因表達(dá)分析以SlCAC基因?yàn)閮?nèi)參基因，不同非生物脅迫和植物激素處理下基因表達(dá)分析以SlEF1a基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物如表1所示。qRT-PCR反應(yīng)體系：5.0 μL 2×SYBR PreMixs，10 μmol/L正、反向引物（qSlGT-33-F和qSlGT-33-R）各0.5 μL，1.0 μL cDNA模板，以去離子水補(bǔ)足至10.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。

1. 2. 7 基因沉默載體構(gòu)建及沉默株系鑒定 經(jīng)過NCBI生物信息學(xué)分析比對(duì)，從SlGT-33基因中鑒定其特異序列，并根據(jù)1.2.3中高保真PCR擴(kuò)增方法得到長度為455 bp的片段，將該片段連接至pMD18-T載體上送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序正確后，采用EcoR I/Kpn I和Xba I/Hind III雙酶切方式將該片段以正向和反向的方式連接至中間載體pHANNIBAL上，然后連接至終載體pBIN19上，最后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。經(jīng)番茄子葉侵染、愈傷組織培養(yǎng)和SlGT-33-RNAi沉默株系鑒定，獲得沉默株系T0代，收集T0代種子，播種后得到T1代植株。

1. 2. 8 CTK含量測(cè)定 番茄植株內(nèi)CTK含量測(cè)定：稱取沉默株系和野生型植株成熟葉片0.5 g，用濾紙吸水后，液氮研磨，用80%甲醇抽提，1000 r/min離心20 min，取上清液，用孔徑為0.45 ?m的濾膜清除雜質(zhì)后，按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作，最后用酶標(biāo)儀在波長450 nm下測(cè)定吸光值（OD）。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定沉默株系和野生型植株成熟葉片中的CTK含量。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，誤差代表樣本數(shù)為3時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，并以t分布進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SlGT-33基因克隆及編碼蛋白氨基酸序列分析結(jié)果

以番茄AC++的cDNA為模板擴(kuò)增得到SlGT-33基因的ORF為1125 bp，共編碼374個(gè)氨基酸殘基，與已知番茄品種1706的同源基因序列（GenBank登錄號(hào)XP004252336.1）（Yu et al.，2015）相比，僅在第61～63位少3個(gè)堿基，GenBank登錄號(hào)為XP00425 2336.1。多重序列比對(duì)分析結(jié)果（圖1）顯示，SlGT-33蛋白含有Trihelix結(jié)構(gòu)域[由第一、二和三螺旋（Helix）組成]、第四螺旋、中央結(jié)構(gòu)域（Central domain）和核定位信號(hào)（NLS），且高度保守區(qū)位于序列上部。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖2）顯示，SlGT-33（GenBank登錄號(hào)Solyc12g043090）與SlGT-17（GenBank登錄號(hào)Solyc-05g018350）聚類在同一分支上，二者氨基酸序列相似性最高，但僅為45.8%（表2），故推測(cè)SlGT-33蛋白具有特異性功能。

2. 2 SlGT-33基因組織表達(dá)特異性分析結(jié)果

由圖3可知，SlGT-33基因除了在莖和成熟葉中的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異（P>0.05，下同）外，在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量均存在顯著差異（P<0.05，下同）;以在莖和成熟葉中的相對(duì)表達(dá)量較高，顯著高于其他組織，其次是花和果實(shí)（綠色果實(shí)和紅色果實(shí)），在根部的表達(dá)量最低，即SlGT-33基因具有組織表達(dá)特異性，且主要在莖和成熟葉中發(fā)揮其調(diào)控功能。

2. 3 SlGT-33基因在外源植物激素處理和非生物脅迫下的表達(dá)分析結(jié)果

由圖4-A可知，經(jīng)IAA、GA3和MeJA處理后，SlGT-33基因的相對(duì)表達(dá)量均與對(duì)照無顯著差異，說明這些植物激素對(duì)SlGT-33基因的相對(duì)表達(dá)無顯著影響;ACC處理4和24 h時(shí)SlGT-33基因的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照顯著降低，推測(cè)ACC抑制SlGT-33基因表達(dá)。SlGT-33基因經(jīng)ABA處理2～24 h時(shí)其表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，處理8 h時(shí)達(dá)最高值，說明SlGT-33基因表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，可能是ABA響應(yīng)基因。

由圖4-B可知，SlGT-33基因在高鹽脅迫和機(jī)械損傷下的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異，推測(cè)高鹽脅迫和機(jī)械損傷對(duì)SlGT-33基因表達(dá)無顯著影響;高溫脅迫和低溫脅迫下，SlGT-33基因的相對(duì)表達(dá)量整體上呈逐漸降低變化趨勢(shì)，尤其是低溫脅迫下，SlGT-33基因表達(dá)降幅較大，在脅迫36 h時(shí)降至脅迫0 h的13.2%，推測(cè)極端溫度抑制SlGT-33基因表達(dá)，尤其低溫脅迫抑制效果更明顯;在脫水脅迫下SlGT-33基因表達(dá)整體上呈逐漸升高的變化趨勢(shì)，脅迫4～36 h時(shí)，SlGT-33基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著（P<0.01）高于對(duì)照，表明脫水脅迫可誘導(dǎo)SlGT-33基因表達(dá)。綜上所述，SlGT-33基因?qū)儆诃h(huán)境敏感型基因，特別是對(duì)極端溫度和脫水脅迫的響應(yīng)最突出。

2. 4 SlGT-33-RNAi沉默株系鑒定結(jié)果

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得SlGT-33-RNAi沉默株系，利用qRT-PCR檢測(cè)各沉默株系中SlGT-33基因的表達(dá)情況（圖5），并與野生型進(jìn)行比較，計(jì)算出沉默效率。結(jié)果顯示，6個(gè)SlGT-33-RNAi沉默株系的沉默效率為64%～83%，其中以RNAi-13株系的沉默效率最高，其次是RNAi-4和RNAi-5株系。但由于RNAi-13株系未結(jié)出果實(shí)和種子。因此，選取RNAi-4和RNAi-5株系作為后續(xù)研究對(duì)象。

2. 5 SlGT-33-RNAi沉默株系幼苗表型觀察結(jié)果

生長70 d的SlGT-33-RNAi沉默株系RNAi-4和RNAi-5幼苗株高均明顯低于野生型（圖6-A），雖然其復(fù)葉結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，但整體尺寸明顯變?。▓D6-B），且花序提前形成（圖6-C），說明相同時(shí)間內(nèi)SlGT-33-RNAi沉默株系的生長較對(duì)照快。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SlGT-33-RNAi沉默株系的株高和節(jié)間長度為野生型的60%左右，均極顯著低于野生型（圖7）?？梢姡种芐lGT-33基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致番茄幼苗矮化，但加速了生殖生長。

2. 6 SlGT-33基因下游基因在SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖中的表達(dá)情況

植株矮化與莖尖生長點(diǎn)發(fā)育有關(guān)，因此本研究以莖尖為材料，檢測(cè)SlGT-33基因下游基因的表達(dá)情況。由圖8-A可知，IPT2和PHAN基因在2個(gè)SlGT-33-RNAi沉默株系的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于野生型，說明SlGT-33-RNAi株系矮化與IPT2和PHAN基因表達(dá)受抑制有關(guān);KNOX2和WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型，說明沉默株系矮化與KNOX2和WUS基因高效表達(dá)密切相關(guān);而KNOX1基因的表達(dá)與野生型無顯著差異。由圖8-B可知，SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織的CTK含量顯著低于野生型，說明抑制SlGT-33基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致CTK合成量減少，且抑制CTK關(guān)鍵合成酶基因IPT2和莖尖發(fā)育關(guān)鍵基因PHAN表達(dá)。

3 討論

3. 1 SlGT-33-RNAi沉默株系幼苗矮化

本研究PCR擴(kuò)增獲得的SlGT-33基因ORF長度為1125 bp，編碼374個(gè)氨基酸殘基，與已知番茄品種1706的同源基因序列（XP004252336.1）（Yu et al.，2015）相比，在第61～63位少3個(gè)堿基，故少編碼1個(gè)氨基酸（谷氨酸），但并未影響蛋白保守區(qū)結(jié)構(gòu)，可能屬于不同品種間的差異。通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SlGT-33基因在莖和成熟葉中的表達(dá)量較高，推測(cè)該基因調(diào)控番茄植株高生長。本研究通過RNAi技術(shù)抑制SlGT-33基因表達(dá)從而得到矮化的番茄植株，進(jìn)一步佐證上述SlGT-33基因調(diào)控植株高生長的推論。前人則通過其他途徑獲得矮化的番茄植株，如Bishop等（1996）通過細(xì)胞色素P450基因突變獲得番茄矮化株;Li等（2019）通過超表達(dá)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因SlMBP9、Sun等（2020）通過抑制YABBY2b基因的表達(dá)分別實(shí)現(xiàn)番茄植株矮化;Tomlinson等（2019）通過阻止赤霉素途徑抑制因子DELLA蛋白的降解也獲得番茄矮化植株，但通過Trihelix家族SIP1亞家族基因獲得番茄矮化植株的報(bào)道還較少見。

3. 2 SlGT-33-RNAi沉默株系矮化與激素調(diào)控密切相關(guān)

本研究發(fā)現(xiàn)，SlGT-33基因表達(dá)可被外源ABA和脫水脅迫誘導(dǎo)，但受極端溫度抑制，故推測(cè)該基因?yàn)锳BA響應(yīng)基因。但大量研究證實(shí)，極端溫度與植物體內(nèi)的ABA含量呈正相關(guān)（Toh et al.，2008;Bi et al.，2020），說明SlGT-33基因調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜。另外，ABA與CTK間存在拮抗作用（Zhai et al.，2020），ABA和CTK同時(shí)受抑制的分子機(jī)理尚未明確 （Nishiyama et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)， 在SlGT-33-RNAi沉默株系中SlGT-33基因表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致CTK合成量同步減少，與上述研究結(jié)果存在差異。因此 SlGT-33作為轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。

3. 3 SlGT-33-RNAi沉默株系矮化與莖尖組織相關(guān)

植株矮化通常與莖的頂端分生組織生長相關(guān)。頂端分生組織（SAM）由中心區(qū)（CZ）、外圍區(qū)（PZ）和髓狀分裂區(qū)（RM）3個(gè)功能區(qū)組成。通過調(diào)控SHOOT MERISTEMLESS（STM）基因的表達(dá)，可改變CZ區(qū)的細(xì)胞代謝（Yanai et al.，2005），進(jìn)而改變莖尖發(fā)育。本研究中，STM基因的番茄同源基因KNOX2在SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型，且Jasinski等（2007）研究證實(shí)，STM基因超表達(dá)后可增加植株葉片的數(shù)量。因此，推測(cè)SlGT-33-RNAi沉默株系花序提前形成與葉片加快形成有關(guān)。而SlGT-33-RNAi沉默株系復(fù)葉變小的原因可能與PHAN基因表達(dá)受抑制有關(guān)，因?yàn)橐种芇HAN基因表達(dá)會(huì)減小番茄葉片的尺寸（Zoulias et al.，2012）。另外，WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型，推測(cè)SlGT-33-RNAi沉默株系頂端分生組織CZ區(qū)的生長受到干擾（Yadav et al.，2011）。在擬南芥中激活STM可促進(jìn)CTK合成（Yanai et al.，2005），而本研究發(fā)現(xiàn)SlGT-33-RNAi沉默株系體內(nèi)KNOX2基因表達(dá)上調(diào)，但CTK合成量減少， IPT2基因的表達(dá)也受到抑制，具體分子機(jī)理有待深入研究。

4 結(jié)論

SlGT-33基因?qū)儆诃h(huán)境敏感型基因，其表達(dá)受ABA和脫水脅迫誘導(dǎo)，但受極端溫度的抑制。抑制SlGT-33基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致番茄植株矮化，其作用機(jī)制與頂端分生組織的CTK合成受抑制、莖尖組織關(guān)鍵調(diào)控基因KNOX2、PHAN和WUS的異常表達(dá)密切相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）