教學(xué)用兔抗人全免疫血清的制備與效價(jià)測(cè)定

張淑莉，武永紅，張 琪，李素芬

(1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系檢驗(yàn)中心 710021；2.陜西省核工業(yè)417醫(yī)院，西安 710600；3.陜西省地方病研究所，西安 710003)

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·臨床探討·

教學(xué)用兔抗人全免疫血清的制備與效價(jià)測(cè)定

張淑莉1，武永紅1，張 琪2，李素芬3

(1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系檢驗(yàn)中心 710021；2.陜西省核工業(yè)417醫(yī)院，西安 710600；3.陜西省地方病研究所，西安 710003)

目的 探討制備高效價(jià)兔抗人免疫血清的方法。方法 將人全血清經(jīng)弗氏佐劑完全乳化，采用一定的免疫程序免疫家兔，末次加強(qiáng)免疫5 d后收集兔免疫血清，利用雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳和間接酶聯(lián)免疫吸附法分別測(cè)定血清中抗體的效價(jià)。結(jié)果 家兔在全程免疫后產(chǎn)生了高效價(jià)抗體，效價(jià)分別達(dá)到了1∶16、1∶8、1∶64 000。結(jié)論 用人全血清免疫家兔，可以獲得高效價(jià)的抗血清，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)教學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

兔抗人免疫血清； 制備； 效價(jià)； 教學(xué)

用人工免疫的方法，將抗原物質(zhì)(人全血清)注入動(dòng)物體(家兔)內(nèi)，可刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，再經(jīng)多次復(fù)種后，抗體的效價(jià)明顯提高，采集其動(dòng)物血液，分離析出血清，即為兔抗人免疫血清(抗體)。免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，動(dòng)物免疫血清也是在醫(yī)學(xué)教學(xué)中，特別是在《臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，例如沉淀實(shí)驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn))、免疫電泳實(shí)驗(yàn)等經(jīng)常要用到的試劑，但目前市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)到的免疫血清價(jià)格昂貴，且效價(jià)也不高，為保證實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)質(zhì)量，筆者選取人全血清免疫家兔，以獲取較高效價(jià)的人全免疫抗血清，并取得了較好效果，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性家兔6只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量2～3 kg，年齡8個(gè)月，無(wú)免疫接種史，作好標(biāo)記后分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 弗氏完全佐劑，生理鹽水，3%戊巴比妥鈉溶液，1.5%瓊脂溶液，0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)，0.05%PBST溶液(pH7.4)，1%牛血清清蛋白(BSA)，酶標(biāo)二抗(HRP-羊抗兔Ab)，TMB底物溶液(A液，B液)，終止液。

1.1.3 設(shè)備與器材 冰箱，離心機(jī)，恒溫水浴箱，電泳儀，微量加樣器，大剪刀(剪兔毛)，止血鉗，眼科手術(shù)剪(剪動(dòng)脈血管)，滅菌三角燒瓶，動(dòng)脈導(dǎo)管，吸管，打孔器，載玻片，濕盒，兔解剖臺(tái)，三通管，20 mL注射器，紗布，聚苯乙烯微量反應(yīng)孔等。

1.2 抗原的制備

1.2.1 人全血清抗原 混合健康人血清20份，其中要包括A、B、AB、O所有血型。人全血清乳化前用無(wú)菌生理鹽水作1∶2稀釋共10 mL。

1.2.2 佐劑抗原的制備 取弗氏完全佐劑10 mL，加等體積稀釋混合人全血清進(jìn)行攪拌乳化，即用1個(gè)三通管的兩端連接2個(gè)20 mL注射器，2個(gè)注射器分別吸入弗氏完全佐劑和混合血清后，然后來(lái)回推注多次，使之成為乳白色黏稠的油包水乳劑。乳化劑的鑒定：將1滴乳化劑滴入冷水中，立刻擴(kuò)散開(kāi)，則為未乳化好，如果保持完整不分散，呈滴狀懸浮于水面，則為乳化完全。

1.3 免疫途徑和程序 初次免疫：選取健康家兔6只，體質(zhì)量2～3 kg，分別注射制備好的加佐劑的人全血清完全抗原；第1次加強(qiáng)免疫：于基礎(chǔ)免疫1周時(shí)背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射人全血清(不含佐劑)抗原；第2、3次加強(qiáng)免疫，均為耳緣靜脈注射人全血清(不含佐劑)抗原。見(jiàn)表1。

表1 抗人全血清免疫程序

1.4 試血 在末次免疫后第5天試血，用無(wú)菌注射器在家兔耳緣靜脈采血1 mL,分離血清，37 ℃溫育1 h，以3 000 r/min離心20 min，吸取上清置于F管中，初步測(cè)定雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)效價(jià)大于1∶16時(shí)，即可收獲血清。

1.5 采集免疫血清 將兔子稱重，以3%濃度的戊巴比妥鈉溶液，按每公斤體質(zhì)量30 mg劑量在耳緣靜脈推注麻醉藥，應(yīng)一邊注射一邊注意觀察每只兔子眼瞼反射、瞳孔和呼吸的變化，麻醉好后將免疫家兔仰面固定于兔解剖臺(tái)上，頭部放低，暴露頸部。剃毛并消毒皮膚。沿頸部中線用手術(shù)刀切開(kāi)皮膚約10 cm，沿氣管鈍性分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌，輕輕分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，可見(jiàn)淡紅色搏動(dòng)的頸動(dòng)脈并作鈍性分離，小心將頸動(dòng)脈和迷走神經(jīng)剝離長(zhǎng)約5 cm，于一側(cè)動(dòng)脈分別套入兩根細(xì)線，一根在遠(yuǎn)心端，一根在近心端。遠(yuǎn)心端用細(xì)線結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾住動(dòng)脈，注意勿損傷血管，用眼科小剪刀在近心端動(dòng)脈壁上剪一“v”形缺口，將事先用肝素浸泡的無(wú)菌動(dòng)脈導(dǎo)管一端插入近心端動(dòng)脈中并固定，動(dòng)脈導(dǎo)管另一端放入滅菌三角燒瓶中，然后緩緩松開(kāi)動(dòng)脈夾，血液很快射入到滅菌三角燒瓶中。將三角燒瓶中的血液置于37 ℃，并做好標(biāo)記，1 h后置于冰箱4 ℃過(guò)夜，待血塊自然收縮后分離血清，分裝凍存保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測(cè)兔免疫血清效價(jià)

1.6.1 雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗血清效價(jià) 取一塊干凈的玻片，將已融化的瓊脂(1.5%)溶液5 mL，緩慢地平鋪在玻片上，使瓊脂厚度約1.5 mm，待瓊脂凝固后，用打孔器打孔(孔徑3 mm，孔間距10 mm)，呈梅花形，挑去孔內(nèi)瓊脂，用移液器加樣，中心孔加抗原原液約20 μL，周?chē)骺装错樞蛞来渭尤?0 μL倍比稀釋抗血清，抗體分別是原液,1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，注意加樣時(shí)(孔加滿為止)不要外溢，不要有氣泡。加完樣后將載玻片置于濕盒內(nèi)，放入恒溫箱37 ℃、擴(kuò)散24 h，觀察有無(wú)沉淀線產(chǎn)生，以出現(xiàn)明顯沉淀線(++)的最高稀釋度作為檢測(cè)血清效價(jià)。

1.6.2 對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗血清效價(jià) 以pH8.6離子強(qiáng)度0.05 mol/L巴比妥緩沖液配成1.5%瓊脂凝膠板，厚度1.5 mm。瓊脂凝固后，用打孔器成對(duì)的打孔，孔徑3 mm，孔間距3 mm，排距8 mm。挑去孔內(nèi)瓊脂，封底。加樣時(shí)一對(duì)孔中，一孔加已知抗原，另一孔加待測(cè)抗體(做系列倍比稀釋分別是原液，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32)，電泳時(shí)將抗原端接負(fù)極側(cè)，抗體端接正極側(cè)，在電場(chǎng)中電泳50 min(6 V/cm)后觀察結(jié)果。

1.6.3 間接酶聯(lián)免疫吸附法鑒定血清效價(jià) (1)用包被緩沖液將抗原(新鮮人全血清)作1∶100稀釋，取12個(gè)反應(yīng)孔，酶標(biāo)板各孔中加稀釋抗原200 μL，放置4 ℃過(guò)夜。第2天棄去孔中液體，PBST洗滌3次。(2)各孔加入1%BSA 100 μL，放置4 ℃封閉過(guò)夜，甩干，PBST洗滌3次。(3)各孔分別依次加入倍比稀釋的待測(cè)兔抗血清100 μL(1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000)，37 ℃溫箱孵育1 h，PBST洗滌5次。(4)每孔加入100 μL(1∶1 500稀釋)的HRP-羊抗兔IgG，同上孵育及洗滌。(5)每孔加入底物溶液100 μL,室溫避光靜置10 min后，每孔加入終止液50 μL,目測(cè)觀察結(jié)果。以上方法均設(shè)有2個(gè)陰性對(duì)照、1個(gè)空白對(duì)照。以陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)作為免疫血清的效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 雙向免疫擴(kuò)散法鑒定結(jié)果 取瓊脂板在黑色背景上觀察抗原抗體孔在1∶16血清稀釋處出現(xiàn)清晰的白色沉淀線，所以沉淀線的最高血清稀釋倍數(shù)為1∶16，證明該動(dòng)物易產(chǎn)生特異性抗體，兔抗血清效價(jià)為1∶16，表示免疫成功。

2.2 對(duì)流免疫電泳法測(cè)定結(jié)果 對(duì)流免疫電泳結(jié)果顯示在1∶8時(shí)形成一條清晰可見(jiàn)沉淀線。

2.3 間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清效價(jià)結(jié)果 在酶聯(lián)免疫吸附法中，隨著低稀釋度到高稀釋度的逐漸增大，孔內(nèi)的藍(lán)色由深逐漸變淺，為陽(yáng)性反應(yīng)，并且呈現(xiàn)一定的梯度性，而2個(gè)陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔沒(méi)有顏色顯示，為陰性結(jié)果，通過(guò)目測(cè)，免疫血清抗體的效價(jià)達(dá)到1∶64 000。

3 討 論

3.1 《臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)》作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)的主干課程，對(duì)培養(yǎng)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)人才至關(guān)重要[1-2]。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是教學(xué)工作的重要組成部分，以培養(yǎng)學(xué)生臨床操作能力、理論聯(lián)系實(shí)際、分析解決問(wèn)題的能力和科學(xué)思維方法為目的，對(duì)實(shí)現(xiàn)素質(zhì)教育和培養(yǎng)創(chuàng)新人才具有重要意義[3]。

3.2 用雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體時(shí)，此法重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，不需要特別儀器設(shè)備，但靈敏度不夠高，可以用對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)來(lái)替代抗體的檢測(cè)，提高效率與靈敏度[4-5]。對(duì)流免疫電泳由于電場(chǎng)的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)散，從而使其定向泳動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短了反應(yīng)時(shí)間。酶聯(lián)免疫吸附法實(shí)驗(yàn)靈敏度高，特異性好，在臨床上得到廣泛應(yīng)用[6]。但是在操作中各環(huán)節(jié)對(duì)檢測(cè)效果影響較大，如抗原抗體的包被濃度、待測(cè)抗體的濃度、酶結(jié)合物濃度及試劑的質(zhì)量控制等，都將會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

3.3 本次實(shí)驗(yàn)使用的人全血清作為可溶性抗原，在首次注射時(shí)加入了佐劑，使得抗原的免疫原性加強(qiáng)，避免了免疫耐受，本實(shí)驗(yàn)在1個(gè)月內(nèi)制備出較高效價(jià)的兔抗人免疫血清，具有免疫時(shí)間短、所產(chǎn)生兔抗人免疫血清效價(jià)高等特點(diǎn)，與文獻(xiàn)[7-10]報(bào)道比較一致。將收集的抗血清應(yīng)用于免疫學(xué)沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，發(fā)現(xiàn)所得的抗血清出現(xiàn)的沉淀反應(yīng)效果明顯,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看, 用人全血清免疫家兔，可以獲得高效價(jià)的抗血清，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)教學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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西安醫(yī)學(xué)院校級(jí)科研基金大學(xué)生科研項(xiàng)目(11DXS11)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.056

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1672-9455(2015)15-2267-03

2015-02-15

2015-03-28)