胃癌中MPZL1的表達及其對胃癌細胞增殖能力的影響

林鳳娟，葛瀟瀟*，吳崢，唐文博，林瑩，李進

0 引言

我國胃癌的發(fā)病及死亡病例數(shù)超過世界胃癌總數(shù)的一半，是造成我國癌癥死亡的第二大原因[1]。胃癌起病隱匿，早期診斷率低，約一半的患者就診時已是晚期。藥物治療是晚期胃癌的主要治療方式，但其療效有限，多數(shù)患者生存期僅一年左右[2]。探索促進胃癌發(fā)展的分子機制可能為其臨床治療提供新的靶點。

MPZL1（myelin protein zero like 1），又稱為PZR（protein zero-related），是屬于Ig-Ⅴ型免疫受體家族的一種細胞膜糖蛋白，最早報道于1998年[3]。在小鼠體內(nèi)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MPZL1同源蛋白在胚胎成纖維細胞中持續(xù)表達，可在纖連蛋白的誘導(dǎo)下，增強細胞遷移能力[4-5]；在牛體內(nèi)，同源蛋白在髓鞘形成以及維持其形態(tài)中發(fā)揮作用，配體尚不清楚，可能與細胞黏附相關(guān)信號通路有關(guān)[6]。早期研究報道MPZL1在人體多個系統(tǒng)組織中有所分布，可能在細胞增殖、分化、運動等方面發(fā)揮重要作用。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MPZL1在肝細胞肝癌中高表達[7]，能夠促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[8]，但是在胃癌中的作用還未見報道。因此，本研究通過在線數(shù)據(jù)庫分析MPZL1與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，觀察MPZL1對胃癌細胞增殖、克隆形成的影響，并探討其機制，從而為胃癌治療新靶點的探索提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國Gibco公司；MPZL1抗體、Vinculin抗體和HRP-標記二抗等均購自美國Abcam公司，MPZL1過表達及敲減慢病毒購自漢尹生物科技（上海）有限公司。RIPA裂解液、蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；熒光定量PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；相機購自日本Canon公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫挖掘MPZL1在多種腫瘤中的表達情況 運用GEPIA數(shù)據(jù)庫研究MPZL1在多種腫瘤中的表達趨勢，以及在胃癌患者中的表達水平。GEPIA數(shù)據(jù)庫是用于分析來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和基因型-組織表達（Genotype-Tissue Expression,GTEx）項目的9 736種腫瘤和8 587個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)[9]。

1.2.2 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫進行MPZL1的mRNA水平在胃癌與正常胃組織表達差異性的分析 采用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析MPZL1的mRNA水平在胃癌與正常胃組織中表達的差異性。UALCAN數(shù)據(jù)庫擁有多種癌癥類型的TCGA RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)，可以在各亞組腫瘤和正常組織樣本中，查詢某個或某些基因的相對表達臨床病理資料以及對腫瘤患者生存時間的影響[10]。

1.2.3 利用KM Plotter和UALCAN數(shù)據(jù)庫進行MPZL1的表達與胃癌患者總生存時間關(guān)系的分析 利用KM Plotter和UALCAN數(shù)據(jù)庫[11]的GC數(shù)據(jù)集進行生存分析。KM Plotter數(shù)據(jù)庫依據(jù)MPZL1的表達量中位值，將胃癌患者分為高表達組和低表達組，UALCAN數(shù)據(jù)庫依據(jù)MPZL1的表達第三四分位數(shù)將胃癌患者分為高表達組和低表達組；通過計算Log rankP值和HR、95%區(qū)間來估算總體生存期，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.4 構(gòu)建MPZL1過表達及敲減的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株 將慢病毒按比例加入待感染的胃癌細胞中，感染48 h后，加入最適濃度的嘌呤霉素（Puromycin）進行藥物篩選，獲得抗性克隆并擴大培養(yǎng)，Puromycin維持10～14天，構(gòu)建穩(wěn)定感染細胞株。

1.2.5 實時熒光定量PCR法檢測 25 μl反應(yīng)體系中包括上下游引物各0.5 μl、2×Mix 12.5 μl（含反應(yīng)緩沖液、dN TP、MgCl2、SYBRGreen、TaqDNA polymerase）、滅菌MQ水11 μl、cDNA 1 μl。PCR反應(yīng)體系如下：10×緩沖液25 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，dNTP（10 mmol/L）0.5 μl，基因上下游引物各0.5 μl，Taq DNA聚合酶25 u，RT反應(yīng)產(chǎn)物1.5 μl，滅菌MQ水加至25 μl；PCR反應(yīng)條件：95℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)，經(jīng)預(yù)實驗確認處于指數(shù)擴增期。GAPDH和MPZL1的讀靶溫度為82℃，將監(jiān)測臨界點設(shè)在PCR擴增過程中，熒光信號由本底進入指數(shù)擴增階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct）作為模板初始濃度的間接指標。在擴增效率達95%～105%時，使用2-ΔΔCt法（Ct代表循環(huán)閾值）計算相對定量比值。GAPDH引物序列為：上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；MPZL1引物序列為：上游：5’-TGTTTCCAGTTTGGGTAG-3’，下游：5’-TGAGATCCAGAAGGCAGA-3’。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達 細胞收集后加入RIPA裂解液常規(guī)方法提取細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30～50 μg蛋白質(zhì)，行10%～15%SDS-PAGE電泳。電泳完畢后，4℃、100 V電轉(zhuǎn)移100 min至0.45 μm PVDF膜上。PVDF膜用含5%～10%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h后，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜后，加入二抗室溫孵育1.5 h，洗膜后，加入顯色曝光液常規(guī)顯像。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞增殖 胃癌細胞株使用含10%FBS的培養(yǎng)基；取2 000個/孔（每孔100 μl）的濃度將處于對數(shù)期的細胞接種到96孔板，每孔設(shè)3個對照；待細胞貼壁后，加入10 μl CCK-8，溫育2 h；用自動酶標儀在450 nm波長處，測定各孔的OD值。連測4 d，最后取各樣本的平均值進行比較。

1.2.8 平板克隆形成實驗 將胃癌細胞株常規(guī)消化重懸為細胞懸液，密度調(diào)整至每毫升250個；在6孔板中，每孔加入2 ml上述密度的細胞，每種細胞設(shè)置3個平行孔；放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天，3～5天更換一次新鮮培養(yǎng)基。每孔加入4%多聚甲醛30 min，然后用1.0%～1.5%結(jié)晶紫染色10～20 min，洗滌晾干后拍照并計數(shù)，獨立實驗重復(fù)3次。

1.2.9 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將胃癌細胞株常規(guī)消化重懸為細胞懸液，離心計數(shù)，將細胞調(diào)至2×106個/毫升，經(jīng)Annexin-V-PE、7AAD標準染色后，利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)均用（）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPZL1在多種惡性腫瘤中呈高表達趨勢

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，MPZL1在彌漫性大B 細胞淋巴瘤（DLBC）、食管癌（ESCA）、多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、肝細胞肝癌（LIHC）、胰腺癌（PAAD）、直腸腺癌（READ）、胸腺癌（THYM）及胃癌（STAD）等多種腫瘤中呈高表達趨勢，與正常組織比較，表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 MPZL1在多種惡性腫瘤中呈高表達趨勢Figure 1 MPZL1 was highly expressed in many malignancies

2.2 MPZL1在胃癌組織中高表達與胃癌組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)

UALCAN數(shù)據(jù)庫分析正常胃上皮組織（34例）和胃癌組織（415例）中MPZL1的表達，結(jié)果顯示：胃癌組織中MPZL1的表達量明顯高于正常胃組織，見圖2A，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.624E-12）。與正常胃上皮組織相比，MPZL1在G1級（12例）、G2級（148例）和G3級（246例）（9例數(shù)據(jù)庫未提供陽性數(shù)據(jù)）胃癌患者中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=3.44E-04，P＜1E-12，P＜1E-12）。在G1級和G3級、G2級和G3級的胃癌患者中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0E+00，P=4.88E-03），而在G1級和G2級的胃癌患者中的表達無明顯差異（G1vs.G2P=7.20E-01），見圖2B。與正常胃上皮組織相比，MPZL1在N1組（112例）、N2組（79例）、N3組（82例）（數(shù)據(jù)庫未提供其他分級）的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜1E-12，P=1.624E-12，P=1.627E-12），見圖2C。以上結(jié)果表明，胃癌組織中MPZL1的高表達與胃癌組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析MPZL1在胃癌中的表達Figure 2 MPZL1 expression in gastric cancer tissues analyzedby UALCAN database

2.3 MPZL1在胃癌組織中高表達與胃癌患者總生存時間可能相關(guān)

對KM Plotter數(shù)據(jù)庫中631例（高表達患者402例，低表達患者229例）胃癌患者總生存時間進行統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，MPZL1高表達與胃癌患者的總生存時間負相關(guān)（P＜0.01），見圖3A。對UALCAN數(shù)據(jù)庫中392例（高表達患者94例，低表達患者298例）胃癌患者總生存時間進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示MPZL1不同表達水平患者之間的總生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.51），見圖3B。

2.4 構(gòu)建MPZL1過表達及敲減的胃癌細胞株

通過MPZL1過表達慢病毒感染MPZL1低表達的胃癌細胞株SGC-7901、SNU-216，利用MPZL1敲減慢病毒感染高表達的胃癌細胞株GTL-16，感染48 h后加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行篩選，收集篩選后的細胞進行檢測。Western blot及熒光定量PCR檢測結(jié)果均提示，感染MPZL1的SGC-7901/MPZL1和SNU-216/MPZL1細胞較轉(zhuǎn)入空載體的SGC-7901/Con和SNU-216/Con細胞中MPZL1的表達水平明顯提高，感染shMPZL1的GTL-16/shMPZL1細胞較感染對照空載體的GTL-16/NC細胞的MPZL1表達水平明顯降低，見圖4。

圖4 Western blot(A)和實時熒光定量PCR(B)檢測胃癌細胞中MPZL1的表達水平Figure 4 MPZL1 expression in gastric cancer cells detected by Western blot(A) and real-time PCR(B)

2.5 過表達MPZL1促進胃癌細胞株的增殖能力

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與SGC-7901/Con、SNU-216/Con組相比，SGC-7901/MPZL1、SNU-216/MPZL1組的細胞增殖能力明顯增強（SGC-7901組：Pd2=0.0171,Pd3=0.0007,Pd4＜0.0001；SNU-216組：Pd3=0.0033,Pd4=0.0024）；GTL-16/shMPZL1增殖能力明顯低于GTL-16/NC組（Pd2=0.0291,Pd3=0.0012,Pd4=0.0088），見圖5。

圖5 CCK-8法檢測胃癌細胞的增殖能力Figure 5 Proliferation ability of gastric cancer cells detected by CCK-8 assay

2.6 過表達MPZL1促進胃癌細胞株的克隆形成能力

SGC-7901/MPZL1組和SNU-216/MPZL1組形成的克隆數(shù)明顯多于SGC-7901/Con組和SNU-216/Con組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（SGC-7901組P=0.0001，SNU-216組P=0.0040），見圖6。GTL-16/shMPZL1組的克隆形成數(shù)顯著低于GTL-16/NC組（P=0.0411）。上述結(jié)果說明，MPZL1能促進胃癌細胞的克隆形成能力。

圖6 平板克隆實驗檢測胃癌細胞的克隆形成能力Figure 6 Colony formation ability of gastric cancer cells detected by colony formation assay

2.7 MPZL1過表達對凋亡信號通路的影響

Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，促凋亡因子Bad、Caspase-7在SGC-7901/MPZL1、SNU-216/MPZL1組中的表達水平均較SGC-7901/Con和SNU-216/Con組明顯降低，GTL-16/shMPZL1組中的表達水平高于GTL-16/NC組，而抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子Caspase-9未見明顯變化，見圖7。流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPZL1過表達后凋亡細胞比例相對減少，敲減后凋亡細胞比例稍有增高，但差異均未達到統(tǒng)計學(xué)意義，見圖8。

圖7 Western blot實驗檢測凋亡相關(guān)蛋白表達變化Figure 7 Apoptosis-related protein expression detected by Western blot

圖8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡Figure 8 Cell apoptosis detected by flow cytometry

3 討論

MPZL1最初是從293細胞中分離出來的SHP2連接蛋白，其Ig結(jié)構(gòu)域同髓鞘蛋白P存在46%同源，胞內(nèi)段含有ITIM（immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif）結(jié)構(gòu)域，借此進行細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細胞增殖、分化、運動等方面發(fā)揮重要作用[4,6,12]。在小鼠細胞中發(fā)現(xiàn)，MPZL1在纖連蛋白的誘導(dǎo)下可以增強細胞遷移能力[5]。但MPZL1在腫瘤中報道并不多。2014年何祥火團隊發(fā)現(xiàn)，肝細胞肝癌（HCC）組織中MPZL1呈高表達，且其表達水平與HCC肝內(nèi)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，MPZL1可能與MPZL1/Src/Cortactin通路相關(guān)[7]。2019年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MPZL1可以通過Src和Fak促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[8]。在膽囊癌和卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MPZL1過表達不僅可以促進轉(zhuǎn)移，也可以促進腫瘤細胞的增殖，Src激酶可能是其作用靶點[13-14]。2020年，在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MPZL-1可能通過影響EMT通路參與調(diào)控順鉑的藥物敏感度[15]。

目前，MPZL1在腫瘤中的相關(guān)報道均提示該基因可能發(fā)揮促進腫瘤發(fā)展的作用，但是在胃癌中的作用沒有進行過探索。因此，為了探索MPZL1在胃癌中的作用，我們首先分析了MPZL1在全球胃癌患者樣本中的表達情況。通過對在線數(shù)據(jù)庫GEPIA進行數(shù)據(jù)挖掘，我們發(fā)現(xiàn)MPZL1在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達趨勢，之后通過UALCAN數(shù)據(jù)庫驗證了MPZL1在胃癌組織中高表達，且與胃癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。進一步分析KM Plotter的數(shù)據(jù)提示，胃癌患者中MPZL1高表達與總生存時間縮短有關(guān)；分析UALCAN數(shù)據(jù)庫的生存數(shù)據(jù)提示，MPZL1不同表達水平的患者之間總生存時間差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義。在目前已發(fā)表的相關(guān)研究中，沒有關(guān)于MPZL1表達與惡性腫瘤患者總生存時間之間關(guān)系的報道[7-8,13-15]。不同在線數(shù)據(jù)庫中，MPZL1表達與胃癌患者總生存時間關(guān)系結(jié)論不一致。本研究缺乏胃癌患者組織標本中MPZL1表達的數(shù)據(jù)結(jié)果及相應(yīng)的病理特征分析，無法對MPZL1在我國胃癌患者中的表達進行深入分析，這是本文的不足之處，后續(xù)我們將進一步開展相關(guān)的研究工作。

我們采用CCK-8法檢測細胞的增殖能力，MPZL1過表達的SGC-7901/MPZL1和SNU-216/MPZL1組細胞增殖能力較對照組明顯增強，敲減組的GTL-16/shMPZL1增殖能力明顯低于對照組（P＜0.05），提示MPZL1在胃癌細胞的生長中起促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)MPZL1過表達后細胞的克隆形成能力顯著提高（P＜0.05），敲減組的GTL-16/shMPZL1組中觀察的克隆形成能力明顯低于對照組（P＜0.05），提示MPZL1提高胃癌細胞株的體內(nèi)成瘤能力。我們的體外實驗結(jié)果基本與數(shù)據(jù)庫中對MPZL1預(yù)測的結(jié)果相符。

細胞凋亡異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，凋亡抑制或減弱是多種癌癥所共有的表現(xiàn)。Caspase家族是細胞凋亡的重要組成部分，通過級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡。有研究證實，Caspase-7的表達與胃癌的進展呈負相關(guān)[16]。Bad蛋白屬于Bcl-2家族，Bad活化后可加速細胞凋亡。Barrezueta等證實Bad與胃癌的增殖能力有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞過表達MPZL1后促凋亡蛋白Bad和Caspase表達減少，敲減MPZL1后其表達增加，提示MPZL1抑制了胃癌細胞的凋亡；流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MPZL1表達水平增加后細胞凋亡比例減少、表達敲減后細胞凋亡比例增高，但并沒有達到統(tǒng)計學(xué)差異。這些提示抑制凋亡可能是MPZL1促進細胞增殖的重要機制之一，但是其具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，MPZL1能夠增強胃癌細胞增殖和克隆形成能力，有可能與下調(diào)促凋亡蛋白Bad、Caspase-7的表達相關(guān)。雖然MPZL1的功能、分子機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚待深入研究，但體外促癌作用提示MPZL1有可能成為胃癌的潛在治療靶點。