Panx1調(diào)控ATP/IP3通路促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡

龍文清，張暉力，謝海娟，王毓興，張麗君，俞紅女，王林

0 引言

肺癌是全球最常見的癌癥相關(guān)死亡原因之一，以高發(fā)病率和高死亡率居于首位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者約占所有肺癌患者人數(shù)的85%[1]。除手術(shù)治療外，肺癌已成為分子靶向治療實體瘤成功的范例?；驒z測技術(shù)的改進(jìn)和普及使分子靶向治療變得更精準(zhǔn)、更有成效，例如肺癌ERBB2、MET、RET、NTRK1和EGFR的聯(lián)合檢測和治療[2-4]。對于錯過最佳手術(shù)治療階段的晚期NSCLC患者，以鉑類為主的多藥聯(lián)合化療方式是主要治療手段。順鉑（DDP）是目前臨床Ⅱ～Ⅲ期完全手術(shù)切除腫瘤的NSCLC患者的主要治療輔助手段[5]。迄今為止，鉑類化療藥物對癌細(xì)胞的毒性作用仍未完全闡明。研究表明順鉑與DNA的結(jié)合效率只有5%～10%[6]。Panx1是Pannexin家族中的一員。Pannexin家族有三個成員，分別是Panx1、Panx2和Panx3。與傳統(tǒng)縫隙連接蛋白通道不同的是，Panx蛋白并不形成具有細(xì)胞與細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換功能的縫隙連接通道，而是只形成同一細(xì)胞本體的胞內(nèi)到胞外形式的單個膜通道[7]。近來研究表明，Panx1通道參與順鉑誘導(dǎo)睪丸癌I-10細(xì)胞的凋亡，而Panx1在順鉑誘導(dǎo)A549凋亡過程中的作用至今仍未見報道。本研究探討Panx1通道在順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（A549）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、含EDTA的胰酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司，不含EDTA的胰酶購自大連索萊寶生物公司，PBS購自美國HyClone公司，Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海詡圣生物公司，增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司，IP3檢測試劑盒購自武漢華美生物公司，MTT和DMSO購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h換液1次，72 h傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞生存率 取10 cm培養(yǎng)皿中生長至50%左右融合度的A549細(xì)胞，胰酶消化、計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞的密度為1×105個/毫升，將細(xì)胞懸浮液鋪至96孔板，10列×6行，每孔100 μl。24 h后更換藥物培養(yǎng)基。實驗共分10組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。Control組不作處理，CBX組：100 μmol/L甘珀酸（CBX）；DDP組：0、2、4、6、8 μg/ml DDP；CBX+DDP組：0、2、4、6、8 μg/ml DDP+100 μmol/L CBX。其中CBX+DDP組提前1 h加入CBX，讓CBX充分發(fā)揮對Panx1的抑制作用。24 h后更換成含濃度為5 mg/ml MTT的培養(yǎng)基，避光操作。繼續(xù)培養(yǎng)1 h。去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μl DMSO，490 nm下讀取每孔吸光度值。

1.2.3 AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞以1×105個/毫升的密度鋪至6孔板，每孔2 ml，培養(yǎng)24 h后，更換藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌細(xì)胞，1500 r/min，4℃，離心5 min，重復(fù)2次。采用100 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI Staining Solution，輕緩混勻。室溫、避光下反應(yīng)15 min。加入400 μl 1×Binding Buffer，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 化學(xué)發(fā)光法檢測胞外ATP釋放濃度 將細(xì)胞以1×105個/毫升的密度接種于12孔板。分為4組：對照組、DDP組、CBX組和CBX+DDP組，每組三個復(fù)孔，不作處理細(xì)胞為對照組，DDP濃度為8 μg/ml，CBX濃度為100 μmol/L。18 h后取細(xì)胞外培養(yǎng)基作為檢測樣品，4℃條件下12 000g離心，離心5 min。將各個樣品裝入黑色96孔板，每孔先加入100 μl按照1:4稀釋好的ATP檢測工作液和20 μl樣品，迅速混勻，將多功能酶標(biāo)儀調(diào)至luminometer檢測模式，避光檢測。

1.2.5 ELISA法檢測胞內(nèi)IP3濃度 細(xì)胞接種、藥物處理及分組與1.2.4步驟一致。藥物處理18 h后，預(yù)冷PBS洗滌一次，置入-20℃冰箱。兩次凍融后，4℃條件下5 000g離心，離心5 min。取上清液作為檢測樣品。取50 μl樣品，加入50 μl酶標(biāo)試劑，再加入50 μl抗體，混勻，37℃，避光孵育1 h。倒掉液體，每孔加入200 μl洗滌液進(jìn)行清洗，靜置10 s，重復(fù)3次。每孔加入50 μl顯色液A和50 μl顯色液B，混勻，37℃，避光孵育15 min。加入50 μl終止液，混勻后置于酶標(biāo)儀下，450 nm波長下讀取每孔吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)比較采用One-way ANOVA分析，組間比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CBX與DDP合用對細(xì)胞生存的影響

結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞生存率為0.9941±0.0042，CBX組的細(xì)胞生存率為0.9905±0.0089，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.557），表明CBX不會對A549細(xì)胞的生存產(chǎn)生影響；2、4、6、8 μg/ml DDP組細(xì)胞生存率分別為（0.9267±0.0252、0.8253±0.0393、0.7445±0.0696、0.6782±0.0365），與對照組比較，DDP組細(xì)胞生存率降低（P=5.34×10-6、8.80×10-10、1.85×10-11、1.79×10-12）；應(yīng)用CBX（100 μmol/L）抑制Panx1通道后，CBX+DDP（2、4、6、8 μg/ml）組的細(xì)胞生存率分別為（0.9692±0.0122、0.9074±0.0109、0.8562±0.0214、0.8129±0.0301），與DDP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），見圖1。

圖1 甘珀酸與順鉑合用對A549細(xì)胞生存的影響Figure 1 Effect of carbenoxolone (CBX) combined with cisplatin (DDP) on survival of A549 cells

2.2 CBX與DDP合用對細(xì)胞凋亡的影響

對照組的細(xì)胞凋亡率為（6.07±0.25）%，單用CBX（100 μmol/L）組的細(xì)胞凋亡率為（6.00±0.05）%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.8 1 5）。結(jié)果證實CBX 不會對A549細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響。單用DDP組（2、4、6和8 μg/ml），細(xì)胞凋亡率分別為（7.48±0.23）%、（13.38±0.21）%、（20.37±0.30）%和（34.75±0.36）%，與對照組比較凋亡率升高（P=0.528、0.007、5.81×10-5、1.10×10-7）。而應(yīng)用CBX（100 μmol/L）抑制Panx1通道的功能后，CBX+DDP（2、4、6、8 μg/ml）組的細(xì)胞凋亡率分別為（6.71±0.11）%、（8.34±0.25）%、（13.77±0.26）%、（26.02±0.46）%，與DDP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.035、0.006、0.012、0.040），見圖2。

圖2 順鉑單用(A)以及與甘珀酸聯(lián)合(B)對A549細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of cisplatin alone(A) and CBX+DDP(B) on apoptosis of A549 cells

2.3 CBX與DDP合用對胞外ATP釋放濃度的影響

對照組細(xì)胞外ATP釋放濃度為1±0.0183，CBX組和DDP組的胞外ATP釋放濃度分別為0.6539±0.0556和1.8828±0.0497，與對照組比較，CBX組細(xì)胞外ATP濃度降低，DDP組細(xì)胞外ATP濃度升高；CBX+DDP組的胞外ATP釋放濃度為1.1969±0.0319，與DDP組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

圖3 甘珀酸與順鉑聯(lián)合對A549細(xì)胞胞外ATP釋放濃度的影響Figure 3 Effect of CBX+DDP on extracellular ATP release of A549 cells

2.4 CBX與DDP合用對胞內(nèi)IP3濃度的影響

對照組的胞內(nèi)IP3濃度為1±0.0287，CBX組的胞內(nèi)IP3濃度為0.9981±0.0020，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.178），表明CBX不會對A549細(xì)胞的胞內(nèi)IP3濃度產(chǎn)生影響；DDP組的胞內(nèi)IP3濃度為1.3202±0.0429，與對照組比較，DDP組的胞內(nèi)IP3濃度升高；CBX+DDP組的胞內(nèi)IP3濃度為1.0143±0.0255，與DDP組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

圖4 CBX與DDP合用對A549細(xì)胞胞內(nèi)IP3釋放濃度的影響Figure 4 Effect of CBX+DDP on intracellular IP3 release of A549 cells

3 討論

肺癌的治療是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的巨大挑戰(zhàn)，大多數(shù)NSCLC患者常在手術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，反映了這類癌癥的侵襲性和患者的預(yù)后不良。對于多數(shù)NSCLC患者，鉑類化療仍然是一種標(biāo)準(zhǔn)治療方法。此外，對于晚期NSCLC患者和需要誘導(dǎo)/輔助治療的早期疾病患者，鉑類中又以順鉑用途最為廣泛。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，與胞內(nèi)DNA結(jié)合成化合物進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。然而，在絕大多數(shù)情況下，暴露于順鉑的惡性腫瘤細(xì)胞能夠激活適應(yīng)性抗性機(jī)制。因此，大部分接受順鉑治療的患者都遇到治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的困擾。

Panchin 等[8]發(fā)現(xiàn)，Panx1 通道是在人體多器官中表達(dá)的由糖蛋白形成的一種半通道。Jalaleddine等[9]研究證實Panx1通道的抑制劑或基因缺失可降低乳腺癌的轉(zhuǎn)移效率。Shi等[10]研究發(fā)現(xiàn)Panx1的高表達(dá)與肝癌的預(yù)后不良相關(guān)，并可促進(jìn)肝癌的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)用shRNA敲除Panx1之后，睪丸癌細(xì)胞（I-10）系的遷移和侵襲能力減弱。這些研究證實在某些腫瘤細(xì)胞中Panx1的表達(dá)上調(diào)，并且可以增加某些腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，選擇性抑制Panx1的表達(dá)和功能可能為某些腫瘤的治療帶來新思路。

Panx1是絕大多數(shù)細(xì)胞類型中ATP流出的主要途徑[12]。Panx1是嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的多功能調(diào)節(jié)伙伴，因為它參與了嘌呤能信號多種生理和病理作用的過程。Panx1的這些作用很大程度上歸因于它們釋放ATP或其他核苷酸的能力，這些核苷酸以自分泌或旁分泌的方式支持嘌呤能信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。ATP可以通過多種途徑參與腫瘤代謝過程，其中一種重要的機(jī)制是在腫瘤細(xì)胞缺氧條件下葡萄糖攝取和糖酵解的增加從而引起ATP水平的變化[14]。

本研究中，在應(yīng)用順鉑的前提下，Panx1通道被CBX高選擇性抑制后，相對于單用順鉑的分組，A549細(xì)胞的生存增加，早期凋亡和晚期凋亡減少?？赡苁怯捎赑anx1通道被抑制導(dǎo)致順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中的一個重要途徑被阻斷所致。相對于單用DDP組，CBX+DDP組的胞外ATP釋放濃度下降，證明Panx1通道是順鉑引起A549細(xì)胞凋亡進(jìn)程中ATP釋放的關(guān)鍵途徑。CBX與順鉑合用后，A549細(xì)胞內(nèi)的IP3的濃度下降。可能是由于Panx1通道被抑制，胞內(nèi)ATP逸出到細(xì)胞外的重要途徑被切斷，導(dǎo)致胞外ATP濃度降低，進(jìn)而使胞內(nèi)IP3的相對濃度減少。

綜上所述，Panx1通道介導(dǎo)的ATP/IP3通路在順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。Panx1通道通過調(diào)控ATP/IP3信號通路增加順鉑對肺腺癌細(xì)胞的敏感度，為改善NSCLC患者的順鉑化療敏感度提供了一定的幫助。