PDA介導(dǎo)的溫和光熱聯(lián)合自噬抑制劑殺傷乳腺癌細(xì)胞

劉雅文，盧佳慧，倪晨，黃潔，黃天濠，沈楠，董玉霖，時(shí)梅林，胡俊峰

0 引言

光熱療法（photothermal therapy,PTT）的基本原理是在近紅外激光照射下，光敏劑吸收光能后，處于激發(fā)單線態(tài)的能量通過內(nèi)部轉(zhuǎn)換和電子振動(dòng)弛豫等無輻射躍遷途徑傳遞，以熱的形式釋放，產(chǎn)生的高熱使腫瘤組織溫度逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)到41.5℃時(shí)會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，當(dāng)溫度繼續(xù)上升超過43.5℃時(shí)會(huì)破壞腫瘤組織內(nèi)部的血管，即PTT治療[1]。雖然光熱療法能有效地抑制腫瘤，但也存在熱分布不均、腫瘤根除不完全和可能引起嚴(yán)重的健康組織損傷等缺點(diǎn)[2]。據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞目前存在不同程度的抗光熱作用，導(dǎo)致腫瘤的無效消融。這種抵抗力主要來源于細(xì)胞內(nèi)的“自噬”機(jī)制[3]。由加熱引起的細(xì)胞損傷可通過自噬過程進(jìn)行修復(fù)和逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死不完整[4]。為了克服這種治療抵抗力，在光熱治療過程中只能選擇更苛刻的條件（如更高的溫度或更長時(shí)間的照射），但是這種方法會(huì)對(duì)周圍正常組織造成更大的損害[5-6]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）是由乳酸和羥基乙酸兩種單體隨機(jī)聚合而成的可降解的高分子有機(jī)化合物，降解終產(chǎn)物為CO2和H2O，不會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生毒副作用，且易通過化學(xué)修飾掌控納米復(fù)合物的粒徑和性能，是目前公認(rèn)的性質(zhì)優(yōu)良的納米載體之一[7-8]。聚多巴胺（polydopamine,PDA）是由多巴胺氧化形成的黑色素樣衍生物，具有生物相容性高、可降解性強(qiáng)、在生物材料表面可自發(fā)沉積形成PDA膜[9]等優(yōu)點(diǎn)，可用于腫瘤的光熱治療[10-11]?；诖?，本研究將自噬抑制劑氯喹（chloroquine,CQ）包載在PLGA內(nèi)，同時(shí)在PLGA表面包覆PDA，制備納米粒子（CQ@PLGA@PDA NPs），用于腫瘤的溫和光熱治療。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

PLGA（50:50，MW:10000）購自德國Evonik公司；聚乙烯醇（PVA）、香豆素-6、4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、CQ和鹽酸多巴胺（dopamlne hydrochlorlde,DA）購自美國Sigma-Aldrich有限責(zé)任公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自中國Melone有限公司；LC3B抗體、P62抗體和β-actin抗體購自中國Proteintech公司。

磁力攪拌器（79HW-1），上海圍誠儀器有限公司；電子天平（FA2204B），上海精密科學(xué)儀器有限公司；透射電子顯微鏡（Tecnai G2 F20），美國FEI公司；納米粒度分析儀（Nano ZS90），英國馬爾文儀器公司；紫外/可見光/近紅外分光光度計(jì)（UH4150），中國天美科學(xué)儀器公司；高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；傅里葉變換紅外光譜（FT-IR,NEXUS-670型），美國Nicolet公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD-2B-80），中國繼譜電子科技有限公司；天能化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-5200 Multi）；實(shí)驗(yàn)用水由實(shí)驗(yàn)室自制，采用凈水系統(tǒng)（Milli-QPlus 185型）純化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CQ@PLGA NPs的制備 采用雙乳化法制備CQ@PLGA NPs。稱取20 mg PLGA，將其溶解在1 ml二氯甲烷（DCM）中，將CQ水溶液（0.2 ml,0.5 mg）加入上述溶液中，對(duì)混合物進(jìn)行超聲處理30 s，得到水/油初乳液（W1/O）。隨后將上述W1/O乳液倒入5 ml PVA溶液（4%）中，繼續(xù)使用20%的振幅超聲處理3 min，得到水/油/水復(fù)乳液（W1/O/W2）。將所得復(fù)乳液加入15 ml的去離子水中，放置在磁力攪拌器上室溫?cái)嚢柽^夜，蒸發(fā)剩余的DCM。去離子水洗滌、離心3次后，棄上清液，冷凍干燥成粉末，將上述材料放在4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CQ@PLGA@PDA NPs納米探針的制備 將上述制備的納米粒子溶于10 ml Tris緩沖液（10 mm,pH8.5）中，加入1 mg DA，緩慢攪拌2 h后，去離子水洗滌、離心3次后，棄上清液，得到黑色CQ@PLGA@PDA NPs溶液，將上述溶液放在4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察材料表征

透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope,TEM）觀察CQ@PLGA@PDA NPs的形貌和結(jié)構(gòu)；馬爾文粒徑儀分析CQ@PLGA NPs和CQ@PLGA@PDA NPs的粒徑大小及電位；紫外-可見光（UV-vis）吸收光譜檢測CQ@PLGA@PDA NPs中CQ的吸收峰，并計(jì)算CQ的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算CQ@PLGA NPs中CQ的包封率；分別對(duì)CQ@PLGA NPs、CQ@PLGA@PDA NPs進(jìn)行傅立葉紅外光譜（FT-IR）測試。

1.4 光熱性能檢測

設(shè)超純水為對(duì)照組，將CQ@PLGA@PDA NPs配制成150、300、450和600 μg/ml的溶液，取1 ml。使用功率為1.0 W/cm2的近紅外808 nm激光照射10 min，各組溫度的變化使用紅外熱成像儀監(jiān)測。

1.5 體外細(xì)胞毒性研究

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測CQ@PLGA@PDA NPs的細(xì)胞毒性。取對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3（來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）經(jīng)胰酶消化后離心洗滌，接種于96孔板中，細(xì)胞密度約為1×104個(gè)/孔，孵育12 h。每孔加入100 μl含有CQ@PLGA@PDA NPs的培養(yǎng)基（濃度梯度為0、150、300、450、600 μg/ml），每個(gè)濃度設(shè)置5組平行實(shí)驗(yàn)，與細(xì)胞共孵育24 h。去除培養(yǎng)基后，在100 μl L-15（含10%FBS）培養(yǎng)基中加入10 μl CCK-8，37℃恒溫培養(yǎng)2 h后測定450 nm波長處吸光度值，參比波長為600 nm。

1.6 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對(duì)CQ@PLGA@PDA NPs的攝入

將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231接種到預(yù)先放有無菌玻片的六孔板中，過夜貼壁后，加入450 μg/ml的載香豆素-6的CQ@PLGA@PDA NPs，分別培養(yǎng)0、1、2、3 h后，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS洗滌3次，然后用DAPI染細(xì)胞核10 min，PBS洗滌3次，采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取情況，藍(lán)色通道激發(fā)波長為340 nm，綠色通道激發(fā)波長為485 nm。

1.7 抑制細(xì)胞自噬增敏光熱殺傷效果

將密度約為1×104個(gè)/孔的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h。將CQ（30.3 μg/ml）、PLGA@PDA NPs（450 μg/ml）和CQ@PLGA@PDA NPs（PLGA@PDA為450 μg/ml、CQ為30.3 μg/ml）加入細(xì)胞中，孵育4 h后，對(duì)其進(jìn)行808 nm激光照射（1.0 W/cm2,10 min）。用CCK-8測定細(xì)胞活性。

為了進(jìn)一步探討體外自噬抑制增敏光熱治療的效果，將密度約為1×104個(gè)/孔的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板中，隨后，PLGA@PDA NPs和CQ@PLGA@PDA NPs的溶液分別在不同濃度（0、150、300、450 μg/ml的PLGA@PDA、0、10.1、20.2、30.3 μg/ml的CQ）下與細(xì)胞孵育4 h，然后進(jìn)行808 nm激光照射（1.0 W/cm2,10 min）。CCK-8試劑檢測細(xì)胞活性。

為了進(jìn)一步證實(shí)CQ@PLGA@PDA NPs對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的治療作用，采用活-死細(xì)胞染色法定性考察光熱效果。材料與細(xì)胞孵育4 h后，分為四組，不同條件處理后，分別用鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（propidium Iodide,PI）處理細(xì)胞。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，密度為每孔4×105個(gè)細(xì)胞。MDA-MB-231細(xì)胞與空白對(duì)照、CQ、PLGA@PDA NPs和CQ@PLGA@PDA NPs孵育6 h，然后采用808 nm激光照射（1.0 W/cm2,10 min）。細(xì)胞用裂解緩沖液裂解，離心后取上清液，加入SDS緩沖液后，將樣品煮沸8 min。在12%SDSPAGE中分離，將分離好的蛋白低溫45 min轉(zhuǎn)移到NC膜上。隨后封閉液封閉2 h，根據(jù)指示蛋白裁剪相應(yīng)的條帶，4℃過夜孵育一抗，之后用洗膜液洗去未結(jié)合的一抗，接著加入二抗，室溫孵育1 h后，洗膜液清洗未結(jié)合的二抗，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行拍攝。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TEM分析CQ@PLGA@PDA NPs的基本性質(zhì)

CQ@PLGA@PDA納米粒子具有明顯的核/殼結(jié)構(gòu)，表面有一層黑色涂層，證實(shí)PDA成功包覆在PLGA的表面，見圖1。

圖1 CQ@PLGA@PDA NPs的透射電子顯微鏡圖Figure 1 CQ@PLGA@PDA NPs observed by transmission electron microscope

2.2 CQ@PLGA@PDA NPs的粒徑和Zeta電位分析

CQ@PLGA NPs和CQ@PLGA@PDA NPs的尺寸分別為（201.10±2.66）nm和（253.10±2.39）nm，見圖2A～B，Zeta電位分別為（-28.86±0.45）mV和（-22.57±0.80）mV，見圖2C。CQ@PLGA@PDA NPs的粒徑明顯增大，表明PDA成功包覆在CQ@PLGA NPs的表面。粒徑儀所測水合粒徑大于TEM圖中所示納米粒子的平均粒徑，推測其原因，可能是由于PIFC NPs分散于水溶液中時(shí)其表面會(huì)形成一層水合殼層，導(dǎo)致水合粒徑略大于TEM圖。

圖2 CQ@PLGA@PDA NPs的粒徑和Zeta電位圖Figure 2 CQ@PLGA@PDA NPs particle size and Zeta-potential diagram

2.3 CQ@PLGA@PDA NPs的紫外-可見光吸收光譜和傅立葉紅外變換光譜結(jié)果分析

CQ、PLGA NPs及CQ@PLGA NPs的紫外吸收光譜結(jié)果顯示，CQ水溶液紫外吸收峰位于344 nm，PLGA NPs在200～800 nm處無相應(yīng)的紫外吸收峰，而CQ@PLGA NPs在344 nm處出現(xiàn)同CQ水溶液相同的紫外吸收峰，證明PLGA成功包載CQ，見圖3A。通過紫外吸收光譜確定CQ標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.03648x+0.02959（r2=0.9999），見圖3B，在此基礎(chǔ)上計(jì)算CQ的平均包封率為（40.38±0.34）%。傅立葉紅外變換光譜圖可見，CQ@PLGA NPs分別在3 500 cm-1和在1 700 cm-1處有代表PLGA的-OH峰和有羰基峰，由于PDA酰胺鍵的剪切和苯骨架的振動(dòng)，CQ@PLGA@PDA NPs在1 091 cm-1、1 176 cm-1、1 267 cm-1、1 392 cm-1和1 625 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰信號(hào)，見圖3C。

圖3 CQ@PLGA@PDA NPs的紫外-可見吸收光譜和傅立葉紅外分析Figure 3 UV-VIS absorption spectra and FT-IR analysis of CQ@PLGA@PDA NPs

2.4 CQ@PLGA@PDA NPs的光熱性能和細(xì)胞攝取

濃度為150、300、450、600 μg/ml的CQ@PLGA@PDA NPs溶液的溫度經(jīng)輻照10 min后分別增加了9.1℃、14.6℃、21.7℃、30℃，但純水僅僅升高了2℃，表明CQ@PLGA@PDA NPs溶液可以快速有效地將光轉(zhuǎn)化為熱能，見圖4A。

MDA-MB-231細(xì)胞中出現(xiàn)了CQ@PLGA@PDA NPs的綠色熒光，且隨著時(shí)間的延長，熒光亮度越來越強(qiáng)，表明CQ@PLGA@PDA NPs能夠被細(xì)胞大量攝取，見圖4B。

圖4 CQ@PLGA@PDA NPs的體外光熱性能和細(xì)胞攝取Figure 4 Photothermal performance and cellular uptake of CQ@PLGA@PDA NPs

2.5 體外細(xì)胞毒性和治療效果

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CQ@PLGA@PDA NPs濃度為600 μg/ml時(shí)，MDA-MB-231和NIH-3T3細(xì)胞的存活率均在95%以上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5A。CQ@PLGA@PDA NPs治療結(jié)果顯示，無激光照射時(shí)，各組細(xì)胞活性無明顯減低，當(dāng)PLGA@PDA NPs溶液（450 μg/ml）經(jīng)NIR照射（1.0 W/cm2，10 min）后，細(xì)胞活力在24 h內(nèi)降低了（45.73±0.49）%，相同照射條件下，負(fù)載了CQ的CQ@PLGA@PDA NPs在24 h內(nèi)細(xì)胞死亡率達(dá)到（79.15±0.51）%，見圖5B。此外，不同濃度（0、150、300、450 μg/ml）PLGA@PDA NPs和CQ@PLGA@PDA NPs溶液經(jīng)照射后，與同濃度和同照射條件下的PLGA@PDA NPs相比，CQ@PLGA@PDA NPs濃度越高，細(xì)胞存活率越低，見圖5C?；?死細(xì)胞染色結(jié)果表明，Ctr組和CQ@PLGA@PDA NPs組對(duì)細(xì)胞無明顯殺傷作用，而PLGA@PDA NPs聯(lián)合近紅外激光照射組，近一半細(xì)胞死亡，負(fù)載了CQ的CQ@PLGA@PDA NPs組，視野內(nèi)觀察到大量死細(xì)胞。說明溫和光熱條件下，CQ@PLGA@PDA NPs具有良好的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，見圖5D。

圖5 CQ@PLGA@PDA NPs的細(xì)胞毒性和治療效果檢測Figure 5 Cytotoxicity and treatment effect of CQ@PLGA@PDA NPs

2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

LC3-Ⅱ蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明，與Ctr組（LC3-Ⅱ/β-actin為0.38±0.02）相比，PLGA@PDA NPs處理的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)808 nm激光照射后，LC3-Ⅱ蛋白在細(xì)胞中明顯增加，其相對(duì)于β-actin的表達(dá)量為（0.94±0.13），在NIR照射下，用CQ和CQ@PLGA@PDA NPs處理的兩個(gè)細(xì)胞組均表現(xiàn)出LC3-Ⅱ蛋白的高表達(dá)，相對(duì)蛋白表達(dá)量分別為（1.11±0.01）、（1.01±0.01），見圖6A～B。這是由于CQ抑制了溶酶體的功能，阻止了自噬溶酶體的降解，而CQ組表達(dá)量比CQ@PLG@PDA略高，則是由于CQ組CQ直接作用于細(xì)胞，而CQ@PLGA@PDA組中的CQ要從材料中緩慢釋放。

P62蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ctr組和PLGA@PDA NPs組P62蛋白含量較低，其相對(duì)蛋白表達(dá)量分別為（0.46±0.04）和（0.52±0.00），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明自噬通路未受抑制；相比Ctr組和PLGA@PDA NPs組，CQ和CQ@PLGA@PDA NPs處理的細(xì)胞，P62含量均顯著增加，其相對(duì)蛋白表達(dá)量分別為（1.08±0.01）和（0.91±0.01），表明CQ使自噬通路受到抑制，見圖6A、C。

圖6 自噬相關(guān)蛋白LC3和P62的蛋白質(zhì)免疫印跡分析Figure 6 Western blot analysis of autophagy-related proteins LC3 and P62

3 討論

雖然光熱治療展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，但在實(shí)際治療過程中仍有許多問題需要解決。目前光熱治療大多應(yīng)用于淺表腫瘤，治療溫度需達(dá)到50℃以上才能有效殺傷腫瘤組織，而過高的溫度會(huì)對(duì)皮膚造成嚴(yán)重灼傷，進(jìn)而引起機(jī)體產(chǎn)生一系列自我防御反應(yīng)（如炎癥因子的釋放），這些防御反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步增加腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，如果能用較低的溫度實(shí)現(xiàn)腫瘤的光熱治療，會(huì)更加符合臨床的實(shí)際應(yīng)用，但是較低溫度下的光熱治療不能有效抑制腫瘤生長[12-13]?；诖?，溫和光熱治療與化療、基因治療、免疫治療等多種治療方式聯(lián)合治療已成為近年來的研究熱點(diǎn)[14-15]。多項(xiàng)研究表明，溫和光熱治療與化療結(jié)合，可以有效解決化療藥物的耐藥問題，增強(qiáng)腫瘤治療效果[16]。Tang和Zhang等[17-18]通過抑制細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白（HSP），在溫和的光熱條件下實(shí)現(xiàn)了有效的腫瘤消融。溫和光熱療法聯(lián)合免疫治療可以解決二者單獨(dú)治療時(shí)的缺陷，Huang等[19]提出了局部共生溫和光熱敏免疫療法（SMPAI），即將溫和光熱療法和免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法相結(jié)合，該療法能夠改善“冷腫瘤”的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)抗PD-L1療法的治療效果。通過可控的治療釋放起到長期抗腫瘤作用，并且可以根據(jù)罹患癌癥個(gè)體的各種需求來實(shí)現(xiàn)所需的預(yù)編程劑量方案。

自噬是細(xì)胞利用溶酶體清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物、受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞原料的循環(huán)再利用，同時(shí)也是細(xì)胞重要的防御與應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，在腫瘤、炎性反應(yīng)、神經(jīng)退行性疾病中具有十分重要的作用[3,20-21]。自噬能夠使腫瘤細(xì)胞抵御外部刺激，增加細(xì)胞耐藥性。藥物抑制自噬或敲除自噬相關(guān)基因可提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度[22-23]。自噬抑制劑氯喹可以抑制細(xì)胞的保護(hù)性自噬，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞光動(dòng)力學(xué)治療的效果[24]。隨著研究的深入，調(diào)控細(xì)胞自噬通路已經(jīng)成為腫瘤治療的新方向[25]。LC3全稱為微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（MAP1LC3），它是一種分子量約為17 kDa的可溶性蛋白，普遍存在于哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中，被認(rèn)為是自噬（尤其是自噬體）形成過程的特異性標(biāo)志物，其中LC3-Ⅱ蛋白被認(rèn)為是檢測自噬的金標(biāo)準(zhǔn)[26]。自噬發(fā)生過程中，LC3蛋白合成后立即在其羧基端被Atg4剪切，產(chǎn)生細(xì)胞漿定位的LC3-Ⅰ，隨后，LC3-Ⅰ會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，產(chǎn)生分子量為14 kDa的LC3-Ⅱ，并定位到自噬小體中。自噬小體中存在的LC3-I和LC3-Ⅱ被當(dāng)作細(xì)胞發(fā)生自噬的分子標(biāo)志，并且LC3-Ⅱ的含量和發(fā)生自噬的程度成正比，一般情況，LC3-Ⅱ條帶的深淺可以表明自噬程度的高低，通過掃描蛋白條帶的灰度值，可以計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，進(jìn)行半定量分析，但由于LC3-Ⅰ條帶較淺，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值存在較大的誤差，因此目前常用LC3-Ⅱ與內(nèi)參（β-actin）的比值進(jìn)行半定量分析，綜合考察LC3-Ⅱ/β-actin比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低[27]。

自噬的發(fā)生需要經(jīng)過以下四個(gè)階段：（1）細(xì)胞內(nèi)貨物被吞噬形成一種雙膜結(jié)構(gòu)；（2）自噬體的形成；（3）自噬體與溶酶體融合產(chǎn)生自噬溶酶體；（4）自噬溶酶體降解。LC3-Ⅱ用來檢測自噬的發(fā)生。本研究激光照射后，PLGA@PDA NPs處理的細(xì)胞組，自噬蛋白LC3-Ⅱ/β-actin的比值升高，表明光熱導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生自噬，而CQ和CQ@PLGA@PDA NPs組在抑制自噬后，LC3-Ⅱ蛋白含量不減反增，這是由于LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變發(fā)生在自噬的前兩個(gè)階段，而自噬抑制劑CQ作用于自噬的最后一個(gè)階段，用于阻止自噬溶酶體的降解，但不會(huì)影響LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，因此，由CQ@PLGA@PDA NPs傳遞的CQ分子并沒有影響LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化，但顯著抑制了溶酶體對(duì)自噬溶酶體的降解現(xiàn)象，使細(xì)胞內(nèi)自噬小泡積累。為了進(jìn)一步證明LC3-Ⅱ相對(duì)蛋白表達(dá)量的增多是由CQ抑制細(xì)胞自噬引起的，本研究檢測了另一種自噬相關(guān)蛋白P62，P62是一種泛素結(jié)合蛋白，與蛋白質(zhì)的泛素化密切相關(guān)，它參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控及自噬過程。自噬過程中，P62與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合，再與定位于自噬小體內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成復(fù)合物，一同在自噬溶酶體內(nèi)降解。因此，出現(xiàn)自噬時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中P62蛋白不斷被降解，P62蛋白含量減少；當(dāng)自噬活性減弱、自噬功能缺陷或被抑制時(shí)，P62蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積，P62蛋白含量增多。P62蛋白含量間接反映自噬通路的阻斷或流通[28-29]。P62蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ctr組相比，CQ和CQ@PLGA@PDA NPs處理的細(xì)胞P62蛋白含量均顯著增加，說明CQ@PLGA@PDA NPs中釋放的CQ分子有效阻斷了細(xì)胞的自噬通路。

本研究所制備的CQ@PLGA@PDA NPs可通過實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)聚集到腫瘤部位[30]。CQ分子通過CQ@PLGA@PDA NPs在細(xì)胞內(nèi)傳遞，顯著減弱腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的降解，有效抑制自噬對(duì)光熱受損細(xì)胞的修復(fù)，從而在溫和近紅外光照射下，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。本研究以調(diào)控細(xì)胞自噬為切入點(diǎn)，通過抑制自噬，減少光熱治療過程中細(xì)胞產(chǎn)生的熱抵抗，提高腫瘤細(xì)胞的光熱治療效果，這將為今后的癌癥治療研究提供一種新思路。但本研究也存在一些不足之處，本研究所制備的納米粒子是利用EPR效應(yīng)聚集于腫瘤區(qū)域，在后續(xù)的研究中，將嘗試在其表面修飾靶向物質(zhì)，如適配體、多肽等，增強(qiáng)其靶向性，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的治療。