人工養(yǎng)殖林麝膿腫病病原菌的分離與鑒定

吳世洲 楊林富 錢麗敏 楊明華 李琦華 陳培富*

(1.云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，昆明，650201；2.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明，650201)

林麝(Moschusberezovskii)屬于國家一級重點保護野生動物，也是用于生產麝香的主要物種，其飼養(yǎng)價值較高，每頭成年麝價格3—5萬元人民幣。作為一種小型野生反芻動物，林麝的人工馴養(yǎng)難度較大，尤其因膿腫病引起的死亡頗多，已成為制約林麝養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素。該病一年四季在各年齡段都會發(fā)生，盡管多數(shù)呈零星發(fā)生，但治愈率低，死亡率高達50%[1]。林麝的膿腫病可分為皮下膿腫和內臟膿腫兩類。皮下膿腫多見于頸部，也見于頭和四肢，用手可觸摸到，較大的膿腫肉眼就能觀察到。內臟膿腫集中發(fā)生于肝臟，往往在林麝病死后剖檢才會發(fā)現(xiàn)。患病林麝表現(xiàn)為不采食、消化不良、發(fā)燒和精神沉郁，如未及時救治，因膿腫病逐漸加重，一兩周內就會死亡。據(jù)報道，引起林麝膿腫的主要病原有大腸桿菌(Escherichiacoli)、化膿隱秘桿菌(Arcanobacteriumpyogenes，舊稱化膿棒狀桿菌Corynebacteriumpyogenes)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和葡萄球菌(Staphylococcusspp.)[2-6]，但臨床用藥的防治效果相當有限，推測可能與人工養(yǎng)殖林麝個體的抗病力普遍較低和病原菌攜帶多種毒力及耐藥基因有關。滇西某林麝養(yǎng)殖場自陜西某地引種數(shù)年以來，深受該病困擾。由于林麝生性容易受驚，不便捕捉觀察，即便患膿腫病也不易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)病麝發(fā)展至重癥才被發(fā)現(xiàn)，以致死亡率居高不下，因此有必要盡快確定膿腫發(fā)生的病因并設法控制該病。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康和患膿腫病林麝各4頭，飼養(yǎng)于滇西某林麝養(yǎng)殖場(海拔2 430 m，年均氣溫10℃)。圈舍與生活區(qū)相距3 m。對該種群采取自然交配繁育，飼料主要由山泉水浸泡過夜的包谷、臨時切成碎片的南瓜塊和購入的新鮮桑葉枝條組成。細菌基因組DNA提取試劑盒購自濟凡生物科技(北京)有限公司，DH5α感受態(tài)大腸桿菌細胞購自北京全式金生物技術有限公司，pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。含體積分數(shù)5%的脫纖維蛋白抗凝綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)為自行配制。

1.2 樣品采集

采集樣品前，觀察病死林麝的臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化。使用一次性滅菌注射器，對存活林麝采集外周循環(huán)血液，病死個體則采集心臟內尚未凝固血液；一份保存于加肝素鈉的采血管，另一份保存于不加肝素鈉的采血管，5 h內送檢血液生理生化指標。無菌采集患皮下膿腫病林麝(3頭)的膿腫組織和死于肝膿腫病林麝(1頭)的肝臟內部組織，用于分離培養(yǎng)病原菌。

1.3 病理顯微觀察

由武漢賽維爾生物技術公司按常規(guī)方法制作病麝肝臟病理切片，鏡檢組織細胞形態(tài)變化。

1.4 細菌分離培養(yǎng)及生化、藥敏試驗

取少許膿汁，均勻涂布于綿羊血瓊脂，放置恒溫箱中37℃培養(yǎng)18—24 h，觀察菌落形態(tài)。選取不同形態(tài)特征的單菌落，劃線接種繼續(xù)培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物。取純培養(yǎng)物轉種于LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫水浴搖蕩培養(yǎng)18—24 h，取部分菌液，按V(菌液)∶V(體積分數(shù)50%的滅菌甘油)=1∶1的比例充分混勻，于冰箱中-80℃保存?zhèn)溆谩⒓兣囵B(yǎng)物分別接種于麥康凱瓊脂和LB瓊脂，37℃培養(yǎng)18—24 h，隨后做革蘭染色鏡檢、生化(甲基紅、乙二酰、乳糖等)試驗和藥物(氨芐西林等13 種抗生素)敏感試驗。對應每個病例各取1個菌落代表菌株用于后續(xù)的試驗研究。

1.5 分離菌株的16S rRNA基因擴增分析

提取菌液DNA，使用細菌16S rRNA通用引物[7]做PCR擴增。反應體系(50 μL)為ddH2O 23μL、Mix 23 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL；擴增程序為95℃預變性5 min；94℃變性50 s、52℃退火45 s、72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。經質量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查符合預期大小的PCR產物，回收純化，插入pMD19-T載體，轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞，從含氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)得到陽性細菌克隆，送上海生物工程有限公司測序，所獲核酸序列利用Blast做在線比對分析。

1.6 毒力基因和耐藥基因PCR擴增檢測

參照文獻報道合成引物，包括腸外致病性大腸桿菌特征基因ompA和毒力基因[8-9]、黏質沙雷菌毒力基因引物[10]及耐藥基因引物[11-14](表1)，均由昆明擎科生物公司合成。PCR擴增30個循環(huán)，除退火溫度設置對不同基因有差異外，其他均按常規(guī)程序操作。PCR擴增條帶經TA克隆及DNA測序驗證。

表1 大腸桿菌和黏質沙雷菌的PCR引物

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

應用DNAstar軟件對分離菌株的核酸序列做同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建；生理生化指標用“平均值±標準差”表示，組間數(shù)值差異用SPSS 20.0軟件做配對t檢驗。

2 結果與分析

2.1 臨床及病理檢查情況

患病林麝體溫升至41℃左右，按該養(yǎng)殖場常用治療方法，取青霉素和鏈霉素做肌肉注射。膿腫發(fā)生于內臟的林麝，死后才被發(fā)現(xiàn)，其身體消瘦，胃內容物酸臭，胃黏膜潰爛；膿腫發(fā)生在肘關節(jié)的林麝，表現(xiàn)為不愿站立，強制驅趕讓其踱步時，患肢提起，不愿落地，表現(xiàn)痛苦；頸部尤其在下頜處發(fā)生膿腫的林麝，膿腫可大似雞蛋，進食速度較慢，吞咽食物困難，日漸消瘦，被及時發(fā)現(xiàn)并做膿腫切開術排膿處理的可存活。剖檢體表未見膿腫的死亡林麝，可見其肝臟大面積發(fā)生膿腫，其他內臟器官無肉眼可見病變。進一步鏡檢肝組織切片，可見肝細胞發(fā)生大面積干酪樣壞死，結締組織層包裹壞死灶且有大量炎性細胞浸潤(圖1)。

2.2 血液生化指標差異

患病組與健康組血清天門冬氨基酸轉移酶(AST)活性分別為(447.25±33.64)、(305.50±14.71)U/L，組間存在顯著差異(P<0.05)，指示患病個體肝功能受損明顯，但未見其他指標存在顯著差異。

2.3 細菌分離鑒定

2.3.1 膿腫來源菌株的基本特性

從肝膿腫只分離得到1種細菌純培養(yǎng)物，記作A樣菌株，其在綿羊血瓊脂、麥康凱瓊脂和LB瓊脂表面形成的菌落顏色分別為乳白色、粉紅色和白色，生化試驗結果顯示其符合大腸桿菌的基本特性。從3頭病麝皮下膿腫分別只分離得到1種(3株)細菌純培養(yǎng)物，記作B樣菌株，其在綿羊血瓊脂和LB瓊脂形成的菌落均為單純乳白色，但在麥康凱瓊脂形成淡黃色菌落，其生化特性符合黏質沙雷菌。A樣和B樣菌株均對青霉素和氨芐西林耐藥，對頭孢曲松、頭孢噻肟、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、痢特靈和氟苯尼考表現(xiàn)為中度或高度敏感。但與B樣菌株相比，A樣菌株還對鏈霉素、慶大霉素和大觀霉素耐藥。

2.3.2 基因擴增

對分離菌株16S rRNA基因進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳得到約1 500 bp的單一條帶。重組pMD19-T質粒經PCR擴增檢查，產物條帶符合預期大小。在線Blast分析顯示，A樣菌株16S rRNA序列與大腸桿菌多個參考菌株的相似性在99%以上，B樣菌株包括分離株1、2、3，其GenBank登錄號分別為MT131168、MT131169和MT131170，與黏質沙雷菌參考菌株KC206270的相似性達99%以上，但與沙雷菌屬內其他種的序列不聚在同一分支(圖2)。由此可判定A樣菌株為大腸桿菌，B樣菌株為黏質沙雷菌。

進一步對大腸桿菌分離株進行10種毒力基因檢測，檢測出腸外致病性菌株相關的外膜蛋白基因(ompA)(圖3)，未檢出其他的黏附素類(afa/draB、iha、sfa/focCD)、鐵轉運系統(tǒng)類(sitDep.a、sitDchr.、iucDa)、血清類(neuC)和毒素類(sat、vat)基因。在黏質沙雷菌分離株中，4種公認的毒素類基因(pHlA、swr、shlA、shlB)均被檢測到(圖4)，表明其有致病性。

3 討論

基于TSA的血瓊脂是適合從臨床樣本分離病原菌的常用培養(yǎng)基。本研究使用該培養(yǎng)基從人工養(yǎng)殖林麝膿腫組織內部分離到黏質沙雷菌和大腸桿菌，表明這2種細菌是引起該養(yǎng)殖場林麝膿腫的直接病原菌。大腸桿菌多數(shù)是腸道正常菌群的組成部分，但某些血清型的大腸桿菌對人和動物具有致病性，并且有腸道致病性和腸外致病性大腸桿菌之分。本研究從死亡林麝肝膿腫組織分離到大腸桿菌，并檢測到腸外致病性大腸桿菌的特征基因ompA，但未檢測到其他毒力基因，提示該大腸桿菌分離株屬于低毒力或機會性的腸外致病性大腸桿菌。黏質沙雷菌廣泛分布于自然界，是水和土壤中的常居細菌，也是臨床上常見的機會致病菌，對人有致病性，但在動物的致病性報道于國內僅見于鱷魚(Crocodylia)[15]和中華鱉(Pelodiscussinensis)[16]。但值得注意的是，本研究從3頭病麝皮下膿腫均分離到黏質沙雷菌，提示其致病性應當受到重視。該養(yǎng)殖場使用山泉水浸泡過夜的包谷飼喂林麝，可能使包谷受黏質沙雷菌污染，進而引起機會感染。值得思考的是，不同學者報道引起林麝膿腫的病原菌種類往往不同[2-6]，本試驗除發(fā)現(xiàn)大腸桿菌，還首次發(fā)現(xiàn)黏質沙雷菌對林麝也有致病性。據(jù)此推測，林麝在人工養(yǎng)殖條件下，易出現(xiàn)免疫功能下降，使各種機會致病菌“有機可乘”，但因不同養(yǎng)殖環(huán)境的優(yōu)勢機會致病菌不同，所以從各養(yǎng)殖場分離得到的膿腫相關細菌種類也時常不同。本試驗分離得到的大腸桿菌和黏質沙雷菌菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、卡那霉素、氟苯尼考高度敏感，必要時可選用這幾種藥物對該場患膿腫個體進行治療；但分離菌株對青霉素類藥物及鏈霉素耐藥，應該與該養(yǎng)殖場長期使用其治療病麝，使病原菌經歷藥物選擇有關。當然，考慮到全身用藥對瘤胃菌群平衡的不利影響，建議對皮下膿腫個體先做穿刺排膿，再做局部注射(封閉)治療。本試驗還發(fā)現(xiàn)患病組血清天門冬氨基酸轉移酶顯著高于正常對照組，提示使用抗生素治療時應同時采取保肝、護肝措施，如增加飼喂鮮綠飼料、注射水溶性維生素或還原型谷胱甘肽，還可在飼料中嘗試添加五味子粉。從該場實施臨床治療的結果看，約有1/3的個體未能治愈，表明及時發(fā)現(xiàn)病例并給予藥物治療是必需的，但這不夠，還需要被治療的個體有良好的免疫力來配合藥物治療。

筆者進一步認為，林麝膿腫病發(fā)生的根本原因是免疫力下降或皮膚、黏膜等生理屏障結構遭到破壞。具體說，飼料種類、飼養(yǎng)環(huán)境及遺傳因素與膿腫病發(fā)生的關系值得重視。林麝在野外生存條件下，對營養(yǎng)物質攝入較為全面或合理。相比之下，人工養(yǎng)殖林麝大多喂予不具足夠適口性的干料或半干料，會導致營養(yǎng)攝取不全面，進而引起免疫力低下，甚至因采食枝條刺傷口咽黏膜，給機會致病菌入侵機體提供了必要的條件，所以膿腫部位形成于頸部的病麝較多。胡周強等[17]發(fā)現(xiàn)，以飼喂干飼料為主的林麝場膿腫病發(fā)生率明顯較高。本試驗所調查的麝場，長期飼喂包谷為主要成分的飼料，鑒于病理剖檢發(fā)現(xiàn)病死個體有胃黏膜潰爛，不排除食入較多淀粉后發(fā)生代謝性瘤胃酸中毒而引起瘤胃壁受損，進而使瘤胃內機會致病菌，如腸外致病性大腸桿菌，沿門靜脈循環(huán)進入肝臟等組織的可能，這與內臟膿腫病集中發(fā)生于肝臟的發(fā)現(xiàn)一致。在人工養(yǎng)殖條件下，林麝的采食習性及生活環(huán)境發(fā)生強制性改變，可能是膿腫病發(fā)生的主要誘因。林麝天性膽小，一受驚嚇便會在圈舍內來回蹦跳，易造成體表損傷，養(yǎng)殖人員難以及時發(fā)現(xiàn)和處理傷口，同時強烈的應激反應會下調免疫力，這些因素均會增加機會致病菌感染的機會。該場工作人員生活區(qū)與林麝圈舍距離近、林麝糞便清理不及時、飼養(yǎng)設施消毒不規(guī)范、膿腫內容物未集中消毒、缺乏病麝專用隔離圈舍，應該與該場林麝膿腫病頻發(fā)有關。筆者認為，改善林麝生活環(huán)境，加強生物安全措施，保證營養(yǎng)供給，適當減少包谷飼喂量，盡量遵循林麝的自然習性，如實施半放養(yǎng)模式，從而改善免疫力，才是預防林麝膿腫病發(fā)生的根本出路。

本研究調查的林麝來自一個數(shù)量約100 頭的小種群，可能也是膿腫病頻發(fā)的一個重要基礎因素。已知動物種群的抗病力受主要組織相容復合體(MHC)等多基因的調節(jié)。MHC是有頜脊椎動物體內負責編碼遞呈抗原肽、啟動特異性免疫應答及卷入炎癥應答的關鍵基因群[18]。國內研究表明，患膿腫病的林麝種群易感等位基因和基因型的頻率均高于抗病等位基因和基因型[19]。人工養(yǎng)殖林麝主要采取自繁自養(yǎng)的管理模式，會加劇林麝種群的退化。尤其是近交繁殖，很容易使MHC多態(tài)性趨于狹窄，這可能是人工養(yǎng)殖林麝易患感染性疾病的重要遺傳因素。因此建議定期從其他養(yǎng)殖場或野生種群引入適當數(shù)量的林麝個體進行繁育，以提高MHC多態(tài)性和群體抗病力，防止近親繁殖引起的麝群退化。最近，國內學者通過比較分析健康和患膿腫病林麝的血液轉錄組，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要是一些與調節(jié)免疫應答有關的基因[20]。本研究認為膿腫病發(fā)生的根本因素在于免疫力下降的觀點與該研究結果是一致的。