體素內(nèi)不相干運(yùn)動成像及微血管密度與宮頸癌病理分級的相關(guān)性研究

冉儀婷，卑貴光

作者單位：1.中國醫(yī)科大學(xué)中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射診斷科，沈陽，110812；2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院 成都市婦女兒童中心醫(yī)院放射科，成都 610091；3.中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射診斷科，沈陽 110812

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，近年來，發(fā)生率日益攀升，現(xiàn)已位于女性中所有惡性腫瘤中診斷率及死亡率第四位[1]。宮頸癌的病理分級對治療方案及預(yù)后有提示作用。磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion-weighted imaging，DWI)作為一種具有無創(chuàng)優(yōu)勢的功能成像技術(shù)，尤其是DWI衍生技術(shù)體素內(nèi)不相干運(yùn)動成像(intravoxel incoherent motion，IVIM)依靠雙指數(shù)模型技術(shù)能將組織內(nèi)的擴(kuò)散運(yùn)動及灌注運(yùn)動區(qū)分開，從而更加準(zhǔn)確地反映腫瘤微環(huán)境狀態(tài)的改變。現(xiàn)今，有研究證明IVIM 各參數(shù)在評價宮頸癌分化程度、病理類型方面也表現(xiàn)出差異及可鑒別性[2-4]，但各IVIM參數(shù)與宮頸癌病理分化程度間的關(guān)系說法尚不一致。宮頸癌的病理級別影響臨床的治療方案，筆者探討IVIM 各參數(shù)與宮頸癌病理級別的相關(guān)性，可以為臨床診療提供參考。

微血管密度(microvesssel density，MVD)可以反映腫瘤組織內(nèi)血管分布，是腫瘤生長、發(fā)展的基礎(chǔ)，且與腫瘤生物學(xué)特征有一定相關(guān)性，能夠提供腫瘤的血供特點(diǎn)和細(xì)胞活性信息，從而判斷腫瘤的進(jìn)展情況。腫瘤的分化程度降低，惡性程度明顯增大，浸潤能力也會進(jìn)一步增強(qiáng)。大量研究證實(shí)腫瘤微血管的增多及血管內(nèi)各血管生成因子的增加，有利于腫瘤細(xì)胞的增殖加速，腫瘤更容易發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移。目前，在泌尿系腫瘤及腦膠質(zhì)瘤等研究中表明[5-7]，血管生成與腫瘤的分級明顯相關(guān)，MVD隨腫瘤分化級別的增高也明顯增加。因此，通過評估MVD可以預(yù)測宮頸癌的病理分化程度，本研究將進(jìn)一步論證，MVD反映的腫瘤灌注方面的信息，以及MVD與IVIM參數(shù)之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性研究中國醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2016年6月至2019 年7 月收治的26 例宮頸癌患者，年齡37～70 (52.9±7.93)歲；低分化患者8 例，高分化患者本6 例，中等分化患者12例；納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)進(jìn)行手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)分化程度；(2)在我院存檔手術(shù)蠟塊；(3)臨床分期＞IA1 期；(4)影像科數(shù)據(jù)站存有手術(shù)前多b 值序列數(shù)據(jù)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)磁共振檢查前接受過放化療；(2)圖像質(zhì)量欠佳。本研究經(jīng)過中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：BL201713)，免除受試者知情同意。

1.2 儀器與檢查方法

MRI檢查采用GE Discovery MR750 3.0 T磁共振機(jī)進(jìn)行常規(guī)掃描，所有患者取仰臥位，腹部8通道相控線圈。掃描參數(shù)：(1)橫斷面T2WI：fs-FRFSE，TR 3896 ms，TE 71.7 ms，視野(FOV)300 mm×225 mm；(2)矢狀面T2WI：fs-FSE，TR 3516 ms，TE 69 ms，F(xiàn)OV 215 mm×270 mm；(3)橫斷面T1WI：FSE，TR 637 ms，TE 9.1 ms，F(xiàn)OV 280 mm×210 mm；(4)冠狀面T2WI：WATER IDEAL，TR 1997 ms，TE 68.6 ms，F(xiàn)OV 280 mm×210 mm，以上序列層厚5 mm，層間距6 mm；(5)矢狀面IVIM DWI 技術(shù)掃描：頻率FOV 28，相位FOV 0.35～0.50，減小矩陣，改變頻率編碼方向，1 次掃描11 個b 值(0、30、50、100、150、200、300、500、800、1200、1500 s/mm2)。病理分級由2名高級別病理醫(yī)生閱片，評估宮頸癌病灶分化程度，根據(jù)宮頸癌的組織學(xué)分級Borders修訂版分級法，分級系統(tǒng)由細(xì)胞異型性、核分裂和角化珠的數(shù)量組成，分為低度惡性的高分化宮頸癌、中度惡性的中分化宮頸癌、高度惡性的低分化宮頸癌；病理學(xué)免疫染色取術(shù)后病變組織，采用甲醛固定，石蠟包埋，行病理切片。用CD34 染色劑染色，采用SP法測定MVD，試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 圖像分析

IVIM 圖像應(yīng)用GE AW4.5 Functool MADC 軟件，利用工作站軟件測量感興趣區(qū)ADC 值，感興趣區(qū)為類圓形，取宮頸癌組織最大截面處，在病灶邊緣勾畫ROI 值，應(yīng)避免囊變、出血、壞死區(qū)，部分較大病灶多點(diǎn)測量，通過雙指數(shù)模型取得IVIM 各參數(shù)：慢速表觀擴(kuò)散系數(shù)(D)、快速表觀擴(kuò)散系數(shù)(D*)，以及灌注分?jǐn)?shù)(f)。病理圖像：于光鏡低倍鏡(×20)物鏡下選擇腫瘤組織內(nèi)MVD 密集處，再于高倍物鏡(×40)下對MVD 進(jìn)行測定，具體方法按照Weidner 等[8]的方法。每個標(biāo)本計(jì)數(shù)5 個視野，取其平均數(shù)，MVD值=(n1+n2+n3+n4+n5)/5。由2名同級別醫(yī)生分別對病灶進(jìn)行二次勾畫，并對各參數(shù)結(jié)果進(jìn)行組間一致性差異檢驗(yàn)，檢查結(jié)果ICC在0.87～0.96。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)判斷不同分化程度患者的IVIM各參數(shù)值是否符合正態(tài)分布，若符合，采用ANOVA檢驗(yàn)對比各組均值；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同分化組中IVIM各參數(shù)與MVD之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌不同病理分級MRI參數(shù)比較

分析宮頸癌不同病理分級組(高分化：G1；中分化：G2；低分化：G3)與IVIM各參數(shù)(D、D*及f值)結(jié)果如表1、2及圖1～3所示。非參數(shù)秩和完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個樣本比較的Kruskal-WallisH檢驗(yàn)結(jié)果(表1)示D值、D*值在三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，f值三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D值隨分化級別增高數(shù)值減低(即低分化組D值中位數(shù)值最低)；D*值中位數(shù)隨分化級別增高數(shù)值逐漸減低。兩兩組間比較(表2)示D值在三組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低分化組D*值低于高分化、中分化組，D*值在低分化與高分化組、低分化與中分化組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高分化組與中分化組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 宮頸癌IVIM D 值在各分化組中分布箱式圖

表1 宮頸癌不同病理分級與IVIM各參數(shù)比較

2.2 宮頸癌各分化組之間微血管密度比較

分析宮頸癌不同分化組(G1、G2、G3)與MVD 結(jié)果如表2 和圖4所示，MVD在不同分化組組間比較，差異皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 比較宮頸癌各分化組MVD 分布箱式圖

表2 三組組間兩兩比較各IVIM各參數(shù)及微血管密度

2.3 IVIM各參數(shù)及MVD之間及與病理分級的相關(guān)性分析

經(jīng)一元線性回歸方程檢驗(yàn)，IVIM 各參數(shù)與MVD 進(jìn)行相關(guān)分析，D*值與MVD 相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；再由方差分析對包含常數(shù)項(xiàng)的回歸方程做顯著性檢驗(yàn)，F(xiàn)=10.6，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，回歸方程有意義(圖5)。直線方程為y (D*)=0.092-0.002×MVD，決定系數(shù)r2=-0.554。D*值與MVD成中度負(fù)相關(guān)(r2為0.41～0.70 表示中度相關(guān))。其他IVIM參數(shù)(D 值、f)與MVD 相關(guān)性分析不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G1、G2 及G3 各組中示例的IVIM 各參數(shù)（D、D*及f 值）、MVD 值如圖6～8所示。

圖5 宮頸癌IVIM D* (ADCfast)值與MVD 的Pearson相關(guān)分析

圖6 女，70歲，高分化宮頸癌。A：DWI與腫瘤的雙指數(shù)分析，在腫瘤邊緣繪制ROI；B：在D參數(shù)圖上，D值為2.17×10-3 s/mm2；C：在D*參數(shù)圖上，D值是2.3×10-2 s/mm2；D：腫瘤標(biāo)本的CD34染色(×400)顯示約17個不成熟的腫瘤微血管 圖7 女，59歲，中分化宮頸癌。A：腫瘤雙指數(shù)分析的DWI圖像；B：在D 參數(shù)圖上，D 值為0.82×10-3 s/mm2；C：在D*參數(shù)圖上，D*值為0.91×10-2 s/mm2；D：腫瘤標(biāo)本的CD34 染色(×400)顯示約27 個未成熟的腫瘤微血管 圖8 女，57 歲，低分化宮頸癌。A：腫瘤雙指數(shù)分析的DWI；B：在D 參數(shù)圖上，D 值為0.12×10-3 s/mm2；C：在D*參數(shù)圖上，D*值為0.62×10-2 s/mm2；D：腫瘤標(biāo)本的CD34染色(×400)顯示約31個不成熟的腫瘤微血管

3 討論

3.1 IVIM各參數(shù)的基本原理、與病理分級的相關(guān)性探討

目前婦科病理學(xué)者主要依據(jù)細(xì)胞形態(tài)將其分為G1、G2、G3級，G1級即高分化型，核分裂不多，惡性程度低；G2、G3級分別稱中、低分化型，核分裂和細(xì)胞異型明顯，惡性程度高。中高分化腫瘤的預(yù)后優(yōu)于低分化腫瘤，但目前病理分級依靠活檢，屬于有創(chuàng)檢查。因此磁共振成像作為無創(chuàng)檢查，判斷宮頸癌病理分級至關(guān)重要。常規(guī)磁共振技術(shù)尚不能滿足腫瘤病理分化分類的需要，IVIM作為新發(fā)展領(lǐng)域，有望解決術(shù)前腫瘤病理分級難題。IVIM 作為DWI 技術(shù)的延伸，通過水分子的微觀運(yùn)動及局部的灌注改變來評估腫瘤組織的擴(kuò)散和灌注特點(diǎn)，可定量測定解析多個模型參數(shù)值，真擴(kuò)散系數(shù)D 值，理論上能去除微循環(huán)快速血流影響，更準(zhǔn)確地反映水分子擴(kuò)散。D*代表與血流灌注相關(guān)的快擴(kuò)散系數(shù)，f 代表灌注分?jǐn)?shù)，可探測到的水占毛細(xì)血管網(wǎng)的體積比[9]。

圖2 宮頸癌IVIM D*值在各分化組中分布箱式圖

圖3 宮頸癌IVIM f 值在各分化組中對比箱式圖

有研究表明，IVIM 參數(shù)與各種腫瘤的病理分級相關(guān)[10]。其中，D*值表示除細(xì)胞間水分子運(yùn)動以外的灌注信息，即病灶內(nèi)血管灌注占較大灌注比例，同時還包括其他脈管系統(tǒng)的灌注情況(例如乳腺導(dǎo)管、唾液腺及胰管等)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D*值隨腫瘤分級的增高而降低，從病理學(xué)角度講，隨腫瘤的分級增高，惡性程度增高，血流灌注也會相應(yīng)增高[12]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。目前，部分研究中關(guān)于D*值與病理分級之間的關(guān)系的結(jié)論也存在分歧，相世峰等[3]和Zhou等[4]研究結(jié)果顯示D*值與病理分級之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Du 等[13]研究表明D*值隨腫瘤分級增加而增高。Federau 等[14]在腦膠質(zhì)瘤IVIM灌注參數(shù)值的研究中顯示D*值與膠質(zhì)瘤的病理分級無意義，這可能與腫瘤內(nèi)大量新生血管生成，微血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)系，此學(xué)者亦指出灌注參數(shù)(D*值、f值)與多種因素相關(guān)，例如血流壓力、血流速度等。李乃玉等[15]提出，D*值隨病理分級增加逐漸減小，可能是由于低分化病灶中微血管存在癌栓，本研究中低分化患者的病理結(jié)果亦表明大多數(shù)病灶中微血管存在癌栓，也支持這種觀點(diǎn)。當(dāng)然，這種理論目前需要大量研究繼續(xù)探究驗(yàn)證。

D值反映細(xì)胞內(nèi)外水分子的擴(kuò)散，在不同分級的宮頸癌病理表現(xiàn)中，分級增高，分化程度越低，細(xì)胞核分化不成熟，核漿比增大，低分化型(G3 級)細(xì)胞異形性明顯，體積增大，因此在顯微鏡下細(xì)胞顯示密集，細(xì)胞外間隙減少。真擴(kuò)散系數(shù)D 值反映細(xì)胞外水分子的運(yùn)動，其主要影響因素是細(xì)胞外間隙及細(xì)胞內(nèi)水分子擴(kuò)散，分化級別越高，細(xì)胞外間隙越小，細(xì)胞外水分子活動受限明顯，表現(xiàn)為D 值隨分級增加而減低。本研究中D 值隨病理分級增高而減低，各病理分化組中統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果均有意義，提示D 值在不同分化程度的宮頸癌中水分子擴(kuò)散運(yùn)動有明顯差異。研究結(jié)果與大多數(shù)研究一致[3,15]。此外，將D值與MVD之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩者無直線相關(guān)性，提示IVIM技術(shù)中的D值能準(zhǔn)確反映微觀擴(kuò)散運(yùn)動，而不受局部灌注的影響。

灌注分?jǐn)?shù)f 在區(qū)分宮頸癌病理分級方面存在爭議，相世峰等[3]研究結(jié)果示f 值在不同宮頸癌病理分級之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；部分學(xué)者研究結(jié)果則相反[15]。在本研究中，f 值與病理分級之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且與MVD 值不具有直線相關(guān)性。導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致可能來源于灌注分?jǐn)?shù)容易受到多種因素的影響，例如微血管網(wǎng)的數(shù)目、血流速度、血管壁壓力或者IVIM 設(shè)定的b 值的不同[11,14]。因此，IVIM 中的灌注分?jǐn)?shù)f在對宮頸癌病理分級的預(yù)測方面需要進(jìn)一步論證。

3.2 微血管生成原理、與病理分級相關(guān)性

血管生成(angiogenesis)是指某些情況下，由于血管生成因子的作用，新生毛細(xì)血管從已有的血管中生長的過程，是許多實(shí)體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[16]。CD34 作為血管標(biāo)記物，能標(biāo)記大部分有明顯血管管腔的血管內(nèi)皮，通過抗體與相應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，可以直接反映微血管的生成狀況，具有腫瘤血管檢測的重要意義[17]。目前，已有一些研究表明，MVD 與腫瘤的分級、預(yù)后有關(guān)系(肝癌、腸癌等)[18-20]，并隨腫瘤級別增高，微血管密度值逐漸增多。Liu 等[21]和馮仙明等[22]學(xué)者研究表明，用CD34染色的宮頸癌中，病理分級越高，MVD值也增高，兩者成明顯線性正相關(guān)，本研究結(jié)果與其一致。

3.3 微血管密度與快速表觀擴(kuò)散系數(shù)(D*)的相關(guān)性

如上文所述，IVIM 中能代表血流灌注的參數(shù)有D*及f 值，假設(shè)D*值能夠代表腫瘤內(nèi)的灌注信息，也就能反映腫瘤內(nèi)MVD，那么，IVIM 參數(shù)D*值就有潛力成為評價腫瘤血管生成方面一個便捷有力的工具。目前，關(guān)于IVIM 中代表灌注的參數(shù)與腫瘤內(nèi)MVD 的關(guān)系研究較少。Liu 等[21]在宮頸癌病理分級與磁共振擴(kuò)散成像的ADC 差值相關(guān)聯(lián)系的研究中提出，宮頸癌的病理分級與ADC差值顯著相關(guān)。ADC差值指的是在多b值條件下，高b值(0～3000 s/mm2)與低b值(0～100 s/mm2)間ADC值的差值，在活體組織中，ADC 最大值來源于腫瘤內(nèi)的微血管網(wǎng)的流動，與IVIM中的D*值意義相似，該研究證實(shí)了ADC差值與MVD 顯著相關(guān)，與宮頸癌中的病理分級顯著相關(guān)。Lee 等[23]在直腸癌的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，多b 值雙指數(shù)模型能夠?qū)U(kuò)散、灌注信息區(qū)分開，IVIM 灌注參數(shù)與MVD 明顯相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。另外，在本研究中，D*值四分位分布區(qū)間較大，波動較大，其原因可能與腫瘤內(nèi)微血管密集區(qū)分布變化大有關(guān)。在顯微鏡下，微血管密集區(qū)常位于癌巢周圍，癌巢分布多位于腫瘤浸潤邊緣，分布散在，這與以上猜測符合。本研究中，快速表觀擴(kuò)散系數(shù)(D*)值與MVD 成負(fù)相關(guān)關(guān)系。兩者之間的研究目前報道極少，D*值影響因素較多，變異性較大，因此兩者之間關(guān)系仍需要大量研究來進(jìn)一步論證。

綜上所述，磁共振IVIM 灌注方面參數(shù)D*值與MVD 密切相關(guān)；在宮頸癌病理分化程度上，D*值能夠區(qū)分出低分化腫瘤，D值可以區(qū)分三種不同分化程度的腫瘤。IVIM參數(shù)在臨床應(yīng)用上，能夠?yàn)樾g(shù)前腫瘤病理分級預(yù)測及臨床治療指向提供有力信息，D*可以作為預(yù)測宮頸癌腫瘤血管生成的一項(xiàng)潛力指標(biāo)。本研究尚有一些地方不足：第一，收集患者樣本量不夠大，特別是低分化組的患者，其原因是該病種由于惡性程度高，生長迅速，首診已是晚期的可能性大，手術(shù)指征大多不滿足，因此病理庫蠟塊樣本較少。第二，腫瘤異質(zhì)性會產(chǎn)生數(shù)據(jù)誤差和偏倚。在腫瘤中有可能分布不同病理分級，而病理診斷是以惡性腫瘤中分級最高的區(qū)域決定的。本文采用多興趣區(qū)測量求平均值、腫瘤邊緣放置測量意在減少這種誤差。第三，在IVIM工作站測量數(shù)值時，本文選擇腫瘤實(shí)性部分測量，部分微小壞死及囊變因素會影響IVIM數(shù)值的改變。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。