舒馬普坦脂質(zhì)體的處方與制備工藝優(yōu)化

屈曉梅，強(qiáng)永在

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

舒馬普坦，化學(xué)名為3-（2-（二甲胺基）乙基）-N-甲基-1H-吲哚-5-甲烷磺酰胺，對(duì)5-HT1D受體具有高度選擇性，可收縮顱內(nèi)血管，改善腦血流供應(yīng)，因此常用作治療偏頭痛[1]。目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)的劑型有注射劑、片劑和鼻噴劑；國(guó)內(nèi)上市銷售的為片劑和膠囊劑，舒馬普坦口服給藥雖然吸收迅速，但首過(guò)效應(yīng)顯著，導(dǎo)致其生物利用度僅為14%[2]；舒馬普坦注射劑起效快，但注射部位反應(yīng)、發(fā)熱、頭暈、惡心、嘔吐等副作用發(fā)生率較高[3]，影響其臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體（liposome）是由卵磷脂和膽固醇制備而成的一種新劑型，具有雙分子層結(jié)構(gòu)，性質(zhì)類似于細(xì)胞膜，囊泡內(nèi)腔可以包裹疏水性或親水性藥物，可以增加難溶性藥物的水溶性、提高藥物的穩(wěn)定性，同時(shí)兼有良好的生物相容性、無(wú)免疫原性、增強(qiáng)靶向性等優(yōu)點(diǎn)[4，5]。因此，為提高舒馬普坦的治療指數(shù)、降低不良反應(yīng)發(fā)生率，本研究擬采用乙醇注入法制備舒馬普坦脂質(zhì)體，在單因素考察的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析法對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位等制劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為開(kāi)發(fā)注射用舒馬普坦脂質(zhì)體提供理論依據(jù)。同時(shí)通過(guò)本研究，豐富舒馬普坦臨床給藥手段，給患者提供更多、更便利的用藥選擇。

1 儀器與試藥

Waters Acquity超高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），LC-500超聲波清洗儀（山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司），2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州生化儀器有限公司），ZEN3690粒徑測(cè)定及ZETA電位儀（英國(guó)馬爾文公司）。

舒馬普坦(廣州雋沐生物科技有限公司，含量＞98%，批號(hào)JM－6430）；卵磷脂購(gòu)自阿達(dá)瑪斯（純度＞98%，批號(hào)011008202）；膽固醇（艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)B61251）；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 舒馬普坦的UPLC測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件[6]Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（25:75，醋酸調(diào)節(jié)pH5），流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5μL，檢測(cè)波長(zhǎng)228nm。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取舒馬普坦脂質(zhì)體懸浮液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取舒馬普坦對(duì)照品14.6 mg，甲醇溶解并定容至100 mL量瓶，作為對(duì)照品貯備液（濃度146μg/mL）。分別精密吸取該對(duì)照品貯備液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mL于10mL量瓶中，流動(dòng)相定容，即得質(zhì)量濃度分別為1.46、7.30、14.6、29.2、43.8、73.0μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=983.42X+564.2（r=0.9997），結(jié)果表明，舒馬普坦在質(zhì)量濃度1.46-73.00μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度之間線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度分別為7.30、29.2和73.0μg/mL的對(duì)照品溶液注入超高效液相色譜儀，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄舒馬普坦峰面積，考察日內(nèi)精密度，結(jié)果RSD分別為0.35%、0.54%和0.42%；另取質(zhì)量濃度分別為7.30、29.2和73.0μg/mL的舒馬普坦溶液，連續(xù)測(cè)定3天，記錄峰面積，考察日間精密度，結(jié)果RSD分別為0.57%、0.64%和0.49%。舒馬普坦的日內(nèi)和日間精密度均＜1%，表明精密度良好，滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣5μL，測(cè)定舒馬普坦峰面積，計(jì)算RSD為1.17%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣5μL，測(cè)定舒馬普坦峰面積，計(jì)算RSD為0.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 回收率試驗(yàn) 取同一批已知濃度的舒馬普坦脂質(zhì)體供試品9份，分別加入相當(dāng)于樣品含量80%、100%和120%的舒馬普坦對(duì)照品儲(chǔ)備液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果舒馬普坦的平均回收率為98.71%，RSD為1.05%，表明方法準(zhǔn)確度較高。

表1 舒馬普坦回收率試驗(yàn)

2.2 舒馬普坦脂質(zhì)體的制備[7]

采用乙醇注入法制備舒馬普坦脂質(zhì)體，具體操作如下：精密稱取處方量的卵磷脂和膽醇，用適量無(wú)水乙醇溶解后，邊攪拌邊加入溶解舒馬普坦的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），水浴超聲30 min得白色混懸液；在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機(jī)溶劑，即得半透明帶有淡藍(lán)色乳光的脂質(zhì)體懸浮液。

2.3 脂質(zhì)體包封率及載藥量的測(cè)定[8]

采用超速離心法分離游離舒馬普坦和舒馬普坦脂質(zhì)體。精密量取制備好的脂質(zhì)體懸浮液1.0 mL，甲醇破乳并定容至5 mL量瓶，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定，帶入回歸方程計(jì)算得到舒馬普坦?jié)舛燃八幬锪浚╓總）；另取等量脂質(zhì)體懸浮液，離心15 min（轉(zhuǎn)速為10000 rpm）濾過(guò)，續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定，帶入回歸方程計(jì)算得到游離舒馬普坦?jié)舛燃坝坞x藥物量（W游離），計(jì)算包封率（%）=（W總-W游離）/W總×100%，載藥量=（W總-W游離）/M總×100%，M總表示脂質(zhì)體總質(zhì)量。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響 固定舒馬普坦/卵磷脂質(zhì)量比為1:15，磷酸鹽緩沖液pH為6.6，水合時(shí)間為20 min，超聲時(shí)間為30 min，旋蒸溫度40℃；改變卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比（3:1、5:1、7:1、9:1、11:1）制備脂質(zhì)體。測(cè)得包封率分別為46.21%、58.47%、50.18%、45.27%、41.68%。結(jié)果表明包封率隨著卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比增加，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比5:1時(shí)，舒馬普坦脂質(zhì)體的包封率最高。

2.4.2 藥物/卵磷脂質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響固定卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比為5:1，其余條件同“2.4.1”，改變舒馬普坦/卵磷脂質(zhì)量比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）制備舒馬普坦脂質(zhì)體，測(cè)得包封率分別為52.18%、56.39%、59.94%、57.21%、55.38%。結(jié)果表明舒馬普坦/卵磷脂質(zhì)量比1:15時(shí)，脂質(zhì)體的包封率最高，比例過(guò)高或過(guò)低，包封率均下降。

2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響 固定卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比為5:1，舒馬普坦/卵磷脂質(zhì)量比為1:15，其余條件同“2.4.1”，超聲時(shí)間分別設(shè)置為10、20、30、40、50 min制備舒馬普坦脂質(zhì)體。測(cè)得包封率分別為46.34%、53.66%、63.37%、59.26%、54.31%。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，舒馬普坦脂質(zhì)體包封率先增大后減小，超聲30 min最為適宜。

2.4.4 水合時(shí)間對(duì)包封率的影響 固定卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比為5:1，藥物/卵磷脂質(zhì)量比為1:15，其余條件同“2.4.1”，水合時(shí)間分別設(shè)置為20、40、60、80、100 min制備舒馬普坦脂質(zhì)體。測(cè)得包封率分別為62.29%、69.32%、65.17%、60.84%、58.59%。結(jié)果表明，40 min的水合時(shí)間最為適宜。

2.5 脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比(X1)，舒馬普坦/卵磷脂質(zhì)量比(X2)，超聲時(shí)間(X3)和水合時(shí)間（X4）4個(gè)影響因素，以包封率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及安排見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)因素及水平

2.5.2 模型擬合 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert軟件處理，包括模型擬合及方差分析，得到回歸方程為：Y=-437.547+22.989X1+17.731X2+7.189X3+9.653X4+0.148X1X2+0.096X1X3+0.0637X1X4-0.1195X2X3-0.0035X2X4- 0.0138X3X4- 2.951X12- 0.0848X22-0.1083X32（R2=0.9615，P＜0.0001），表明擬合的模型具有顯著性；而失擬項(xiàng)P＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，綜上得出所擬合模型可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際情況。根據(jù)擬合結(jié)果，繪制3D效應(yīng)面圖和2D等高線圖，分析影響舒馬普坦脂質(zhì)體包封率的因素以及因素間的相互作用，綜合效應(yīng)面、等高線圖及方差分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)X1、X3、X4、X2X3、X12、X22、X32、X42的P值均小于0.05，表明其對(duì)包封率影響顯著。利用Design Expert軟件，以包封率最大為指標(biāo)，預(yù)測(cè)超聲法制備舒馬普坦脂質(zhì)體的最優(yōu)工藝為：卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比5.4:1，舒馬普坦/卵磷脂質(zhì)量比1:14，超聲時(shí)間31 min，水合時(shí)間42 min，預(yù)測(cè)包封率為77.01%，按此處方工藝制備3批舒馬普坦脂質(zhì)體，測(cè)得包封率分別為76.74%、77.19%和76.84%，平均值為76.91%，RSD為0.32%，與預(yù)測(cè)值較為接近，說(shuō)明該模型準(zhǔn)確可靠，可以用響應(yīng)面法對(duì)舒馬普坦脂質(zhì)體的處方及制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.6 脂質(zhì)體載藥量、粒徑和Zeta電位的測(cè)定

取最優(yōu)工藝下制備的舒馬普坦脂質(zhì)體，測(cè)定計(jì)算其載藥量為8.42%（w/w）；另將舒馬普坦脂質(zhì)體懸浮液稀釋一定比例，用馬爾文粒度分析儀測(cè)定，結(jié)果平均粒徑為（172.2±18.4）nm，多分散指數(shù)（PDI）為（0.216±0.003），Zeta電位為（-21.3±1.6）mV。

表3 試驗(yàn)安排及結(jié)果

圖1 包封率與各因素間的3D效應(yīng)面圖

3 討論

脂質(zhì)體的制備方法有薄膜分散法[7，8]、乙醇注入法[9]、冷凍干燥法[10]和逆向蒸發(fā)法[11]等，預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別用以上幾種方法制備舒馬普坦脂質(zhì)體，結(jié)果以乙醇注入法包封率最高，且具有操作簡(jiǎn)便，材料環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，因此確定舒馬普坦脂質(zhì)體制備方法為乙醇注入法。脂質(zhì)體包封率的常見(jiàn)測(cè)定方法有透析法[12]、高速離心法和葡聚糖凝膠小柱法等[13]，透析法需在透析袋內(nèi)外游離舒馬普坦擴(kuò)散達(dá)平衡后進(jìn)行測(cè)定，這一過(guò)程需要10 h，等待時(shí)間較長(zhǎng)。本試驗(yàn)嘗試用自制葡聚糖凝膠小柱分離脂質(zhì)體，結(jié)果葡聚糖凝膠對(duì)舒馬普坦保留率較低，不能將脂質(zhì)體與游離藥物有效分離。高速離心法操作簡(jiǎn)便，本研究發(fā)現(xiàn)高速離心15 min后脂質(zhì)體可沉積于離心管底部，實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體與游離藥物的有效分離，因此本試驗(yàn)選擇超速離心法測(cè)定包封率。

確定了脂質(zhì)體的制備方法和包封率的測(cè)定方法后，選擇卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比，舒馬普坦/卵磷脂質(zhì)量比，超聲時(shí)間和水合時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，初步確定了最優(yōu)值的范圍，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了4因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到舒馬普坦脂質(zhì)體的最佳制備工藝，驗(yàn)證試驗(yàn)表明此條件下制備的舒馬普坦脂質(zhì)體包封率為（76.91±0.24）%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明預(yù)測(cè)的工藝合理可行。本方法制備的脂質(zhì)體載藥量略低，可能與卵磷脂用量較高有關(guān)（舒馬普坦/卵磷脂為1:14），載藥量與文獻(xiàn)報(bào)道接近[14，15]。今后工作需從輔料選擇及制備工藝兩方面入手，通過(guò)考察選擇優(yōu)良的高性能輔料，再經(jīng)進(jìn)一步的處方優(yōu)化，制備出包封率與載藥量均高的脂質(zhì)體。