基于網(wǎng)絡藥理學探討中藥復方黃連湯治療胃潰瘍的作用機制

楊立波，張 謙，王 丹

（1.巴彥淖爾市醫(yī)院消化內科，內蒙古 臨河 015000；2.內蒙古醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心；3.內蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院）

胃潰瘍是最普遍的胃腸道疾病之一，嚴重影響了人們的生活[1～3]。幽門螺桿菌感染是全世界胃慢性炎癥的最常見原因[4～9]?；颊呖诜T如阿莫西林，克拉霉素和甲硝唑等抗菌藥物來治療感染幽門螺桿菌取得了一定療效，但與此同時，患者對這些抗菌藥物的耐藥性也在逐年增加[10，11]。因此，迫切需要開發(fā)新的抗幽門螺桿菌的治療方法，尤其是中草藥，復發(fā)率低且副作用小[12～15]，易于獲得，在很大程度上減輕了患者的經(jīng)濟負擔。

中藥復方黃連湯來源于《圣濟總錄》卷一七八，由黃連，干姜，艾葉和烏梅四味中藥組成，具有平調寒熱，和胃降逆的功效，本研究以網(wǎng)絡藥理學為工具和實驗方法，探究黃連湯治療胃潰瘍的的活性成分和主要作用靶標，為其下一步機制作用的研究和實驗驗證打下基礎。

1 方法

1.1 黃連湯化合物成分收集

在Pubmed，中國知網(wǎng)和中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索：黃連、干姜、艾葉、烏梅，以OB≥30%（oral bioavailability，生物利用度）和DL≥0.18（drug-likeness，類藥性）篩選黃連湯潛在活性成分以及這些活性成分所對應的可能靶點，根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對黃連湯潛在活性成分以及這些活性成分所對應的可能靶點的名稱進行縮寫標準化。

1.2 胃潰瘍發(fā)病機制相關的疾病基因的收集

在Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）兩個疾病數(shù)據(jù)庫中以“gastric ulcer”為關鍵詞檢索與胃潰瘍發(fā)病機制相關的基因，對兩個疾病數(shù)據(jù)庫里篩選得到的基因進行整合，剔除重復基因，查閱文獻刪除無關基因，最后整理得到與胃潰瘍發(fā)病機制密切相關的疾病基因。

1.3 黃連湯-胃潰瘍交互靶點的獲取

將1.1和1.2中整理得到的txt文件導入R語言平臺，按照事先寫好的程序運行R軟件后得到黃連湯-胃潰瘍交互靶基因，利用交互靶基因繪制韋恩圖。

1.4 黃連湯復方調控網(wǎng)絡構建

運行R軟件后得到黃連湯-胃潰瘍交互靶基因，將此交互靶基因txt文件導入Cytoscape 3.8.0，然后對黃連湯成分以及作用靶點等屬性進行標示，運行軟件，調整修飾后導出黃連湯復方調控網(wǎng)絡。

1.5 構建黃連湯-胃潰瘍蛋白互作網(wǎng)絡

將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因txt文件導入STRING在線網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/cgi/input.pl），相互作用評分閾值＞0.900，研究對象選擇人種，對于網(wǎng)絡脫節(jié)的游離基因進行隱藏，導出黃連湯-胃潰瘍蛋白互作網(wǎng)絡和string_interactions文件。

1.6 通過蛋白相互作用網(wǎng)絡獲取核心基因

將1.5中獲得的string_interactions導入Cytoscape 3.8.0軟件中，利用cytoNCA插件對BC（betweenness）、CC（closeness）、DC（degree）、EC（eigenvector）、LAC（local average connectivity-based method）進行兩次打分，根據(jù)得分大于中位值的基因，篩選作為PPI網(wǎng)絡核心基因。

1.7 GO與KEGG通路富集分析

將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因txt文件導入R平臺進行GO數(shù)據(jù)庫與KEGG數(shù)據(jù)庫富集分析。富集分析皆以P＜0.05為篩選標準。

2 結果

2.1 黃連湯化合物成分收集

通過Gene Card、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到5148個胃潰瘍相關靶點基因。運用R語言得到藥物-疾病交互靶點148個（見圖1）。

圖1 黃連湯-胃潰瘍交互靶點韋恩圖

2.2 中藥復方調控網(wǎng)絡構建

此網(wǎng)絡中有23個主要化合物成分，有148個胃潰瘍疾病靶點（見圖2）。主要化合物成分及作用靶點圖如表1所示。

圖2 化合物-靶標網(wǎng)絡

表1 主要成分及靶點

2.3 PPI網(wǎng)絡的構建及其網(wǎng)絡核心的篩選

PPI網(wǎng)絡如圖3A所示。經(jīng)過兩次打分BC≥66.977486385，CC≥0.2036639875，DC≥6，EC≥0.0363098645，LAC≥2，NC≥3.05和BC≥15.40516585，CC≥0.526315789，DC≥8，EC≥0.122935086，LAC≥4，NC≥5.219516595，根據(jù)得分大于中位值，最終共篩選出網(wǎng)絡核心基因15個，分別為TP53、CDKN1A、AKT1、HIF1α、FOS、MYC、JUN、EGFR、NR3C1、MAPK1、RB1、CCND1、ESR1、RELA、MAPK8（見圖3C）。

圖3 PPI網(wǎng)絡核心基因

2.4 GO數(shù)據(jù)庫富集分析

運用R軟件將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因進行GO數(shù)據(jù)庫富集分析（見圖4），GO數(shù)據(jù)庫富集分析共計2412條，包括2152條生物學過程（biological process，BP），190條分子功能（Molecular Function,MF）和70條細胞成分（cellular component，CC）。設定P＜0.05為閾值標準進行過濾，按照P值由小到大分別選取生物學過程、分子功能和細胞成分中前10條通路繪制GO通路圖。

圖4 GO富集分析

2.5 KEGG富集結果分析

運用R軟件將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因進行KEGG數(shù)據(jù)庫通路富集分析，總計得到160條涉及黃連湯-胃潰瘍相關信號通路，設定P＜0.05為閾值標準進行過濾，按照P值由小到大選取前30條通路繪制KEGG信號通路圖（見圖5）。

圖5 KEGG富集分析

3 討論

本研究篩選到的黃連湯治療胃潰瘍的主要活性成分為黃連堿、β谷甾醇、山柰酚、槲皮素等，均具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增強機體免疫等多種藥理作用，說明這幾種化合物可能是黃連湯治療胃潰瘍的物質基礎。

通過疾病-成分-靶點網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)TP53、CDKN1A、AKT1、HIF1α、EGFR可能是黃連湯治療胃潰瘍的關鍵靶點。TP53信號通路異常激活可能是其對酒精和阿司匹林致胃潰瘍損傷保護作用的重要機制之一。CDKN1A作為細胞內信使調節(jié)細胞的增殖與胃潰瘍甚至胃癌直接相關。Akt信號通路在大鼠胃潰瘍的發(fā)生和愈合過程起到關鍵作用。HIF-1α被確定為與幽門螺桿菌感染激活的細胞周期停滯傳遞的介體。EGF基因與受體EGFR在特定細胞表面相互作用并且結合后，能夠激活一系列細胞級聯(lián)反應，從而促進細胞增殖和遷移達到增加傷口愈合的作用。同樣的，EGF受體所介導的下游Ras/Raf/ERK1/2信號通路，也在特定類型的細胞增殖過程中發(fā)揮關鍵作用。

GO分析結果顯示，黃連湯治療胃潰瘍涉及的生物學過程主要包括對氧化應激、脂多糖及活性氧等于氧化應激相關的反應，這些反應均與免疫和炎癥相關。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，PPI網(wǎng)絡的關鍵靶點主要富集于AGE-RAGE、TNF、IL-17、P53、HIF-1等與免疫、炎癥反應調節(jié)相關的信號通路。因此，我們推測，藥物有效成分可能通過AGE-RAGE、MAPK、P53、HIF-1等炎癥信號通路以及Ras/Raf/ERK1/2通路上的不同靶點來達到治療胃潰瘍的目的。

綜上所述，黃連湯在“多成分-多途徑-多靶點”協(xié)同調控的背景下發(fā)揮治療胃潰瘍，并起到抗氧化、抑制炎性反應、調節(jié)免疫等多種生物學作用。與此同時，由于網(wǎng)絡藥理學只是網(wǎng)絡大數(shù)據(jù)的整合和統(tǒng)計，因此，在一定程度上具有局限性，只能作為續(xù)基礎的理論階段。在下一步的研究中心，我們將會圍繞網(wǎng)絡藥理學中得到的黃連湯活性成分、作用靶點及治療胃潰瘍相關信號通路作進一步實驗驗證，從而為黃連湯治療胃潰瘍提供可靠的科學依據(jù)，也為后續(xù)治療胃潰瘍藥物研發(fā)打下基礎。