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    臍帶血間充質干細胞移植治療大鼠心肌病的初步研究

    2021-08-02 01:22:14張靜悅張世恒楊月明劉伶
    健康之家 2021年3期
    關鍵詞:移植阿霉素心肌病

    張靜悅 張世恒 楊月明 劉伶

    摘要:目的:臍帶血間充質干細胞移植對大鼠心肌病的影響。方法:采用阿霉素誘導大鼠心肌病模型,提取臍血間充質干細胞,尾靜脈注射進行治療,10 d后處死大鼠,檢測炎癥介質與心肌酶等指標。結果:心肌病模型大鼠心肌組織壞死面積明顯增大,腫瘤壞死因子-a、白介素-6、白介素-10、B型腦鈉利肽、心臟I型膠原含量均顯著升高,肌酸激酶和同工酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶含量均顯著升高。臍血間充質干細胞治療后,大鼠心肌組織壞死面積明顯縮小,腫瘤壞死因子-a、白介素-6、白介素-10、B型腦鈉利肽、心臟I型膠原含量均顯著下降,肌酸激酶和同工酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶含量均顯著下降。結論:臍血間充質干細胞是治療阿霉素誘導的大鼠心肌病的一種新方法。

    關鍵詞:臍血間充質干細胞,阿霉素,心肌病,心肌功能,移植

    臍帶血干細胞(MSCs)具有多向分化的優(yōu)勢和強大自我更新潛能,且來源豐富、易于采集、對供者無傷害、不受倫理及法律限制、分化性強、免疫原性低等優(yōu)勢,是治療心血管疾病的研究熱點[1]。本研究成功建立了高劑量阿霉素誘導的大鼠心肌病模型,檢測MSCs治療前后血漿細胞因子水平、心肌I型膠原比例、心肌酶表達及B型腦鈉利肽(BNP)水平,為MSCs治療心肌病提供臨床依據(jù)?,F(xiàn)報道如下:

    1資料與方法

    1.1 實驗動物

    8周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。單獨飼養(yǎng),自由進食和飲水。放置在相對濕度40%~70%、溫度20℃~25℃的房間中,每小時換氣10~15次。光照時間為23:15~11:15 h,光照強度為60~80 lux。隨機分為WKY對照組(WKY-C)、WKY-ADR模型組(WKY-M)和WKY心肌病治療組(WKY-T),每組20只。WKY-C組給予正常復合飼料,0.9%生理鹽水腹腔注射,1次/周,共10周。WKY-M組給予正常飼料(不含ADR),腹腔注射阿霉素(ADR),2.5 mg/kg,1次/周,持續(xù)10周。WKY-T組給予正常飼料(不含ADR),腹腔注射ADR,2.5 mg/kg,1次/周,持續(xù)10周,采用尾靜脈注射臍帶血MSCs(108 cells ml,100 μl)。

    1.2 MSCs培養(yǎng)

    取自無菌條件下自然出生或剖腹產的健康嬰兒。收取臍帶血,肝素抗凝,將臍帶血與D-hanks液按1:1比例混合,慢慢加入淋巴分離液中。稀釋后的臍血和人淋巴細胞分離液以2000 r/min離心20 min,提取白膜層MSCs。MSCs加入D-hanks液,1000 r/min離心5 min,棄上清。采用低糖DMEM (DMEM-LG,pH7.4)或Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)。繪制原代臍血MSCs和P2臍血MSCs的生長曲線。在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)的臍帶血MSCs進行觀察和拍照。選擇生長良好的P2臍血間充質干細胞制備細胞懸液,CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90熒光標記,流式細胞儀分析染色細胞。

    1.3 大鼠心功能測定

    腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(35 mg/kg)麻醉法術。測量大鼠心功能,包括左心室舒張末期尺寸(LVEDd)、左心室收縮舒張末期內徑(LVESd)、左心室射血分數(shù)(LVEF)和左心室短縮率(LVFS)。

    1.4 HE染色

    取心臟標本,10%福爾馬林固定,包埋,切成4 μm薄片。蘇沐瑾和伊紅染色分析。

    1.5 ELISA檢測

    大鼠眼眶取血,110 g離心10 min,-20℃保存。ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、B型腦納肽(BNP)、心臟I型膠原含量。

    1.6 心肌酶檢測

    試劑盒購自南京建成生物工程研究所,檢測心肌天門冬氨酸轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和同工酶(CK- mb)含量。

    1.7 Masson染色

    試劑盒購自上海波谷生物技術有限公司。Masson染色觀察心肌膠原。

    2統(tǒng)計學分析

    數(shù)據(jù)均以平均值的標準誤差(SEM)表示。采用GraPHPad Prism,students雙尾未配對t檢驗進行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    3結果

    3.1 MSCs鑒定

    原代培養(yǎng)7 d后,臍血間充質干細胞由圓形變?yōu)樗笮?。隨著培養(yǎng)時間的延長,貼壁生長細胞逐漸減少,形成集落,細胞呈漩渦狀排列。4周后臍血MSCs可融合成單層細胞,5~7 d即可基本覆蓋瓶底。P2的MSCs形態(tài)均勻,沒有明顯變化(見圖1A)。MSCs接種后第1 d和第2 d細胞增殖無明顯變化。從第三天起MSCs細胞的數(shù)量急劇增加,呈現(xiàn)對數(shù)生長,在6~7 d達到增長高峰。原代和P2細胞的生長曲線基本一致,表明傳代后細胞仍能保持良好的生長速率(見圖1B)。此外,這些MSCs均呈CD11b、CD29、CD90陽性表達,CD34、CD45表達陰性,并有向成骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞分化的潛能(見圖1C)。

    3.2 WKY-C組與模型組左室各指標對比

    排除在建立心肌病模型過程中死亡的大鼠。模型組動物在心肌病發(fā)生10周后,左室LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS高與WKY-C組(P<0.01),提示心功能下降。見表1。

    3.3 造模前后因子表達變化

    與WKY-C組相比,WKY-M組大鼠心臟心臟I型膠原含量、BNP水平、心臟AST水平、LDH、心肌酶CK、CK-mb、IL-6、IL-10、TNF-a水平均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.5)。

    3.4 MSCs移植后心功能變化

    與WKY-C組相比,模型組動物左室各指標升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),MSCs移植后,左室各指標均下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示心功能恢復。

    3.5 MSCs移植后因子變化

    與WKY-C組相比,WKY-M組大鼠心臟I型膠原含量水平升高(P<0.01),MSCs移植后,大鼠心臟I型膠原含量水平降低(P<0.5)。與WKY-C組相比,WKY-M組大鼠心臟BNP水平升高(P<0.01),MSCs移植后,大鼠心臟BNP水平降低(P<0.5)。與WKY-C組相比,WKY-M組大鼠心臟AST水平、LDH水平、心肌酶CK、CK-mb水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.5),MSCs移植后均降低。與WKY-C組相比,WKY-M組大鼠血清炎癥介質IL-6、IL-10、TNF-a水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.5),MSCs移植后均降低(P<0.5)。

    4討論

    ADR誘導心肌病模型的病理、血流動力學和激素變化與人類充血性心力衰竭的表現(xiàn)類似。因此,本研究建立了ADR心肌病大鼠模型,為分析心肌病的發(fā)病機制、心力衰竭及新的治療措施提供基礎[2]。

    心臟膠原蛋白是心臟間質的重要成分,其形態(tài)改變以及各種膠原蛋白的比例變化對心臟功能也有重要影響。許多心臟病與膠原蛋白比例失衡密切相關,目前,心肌膠原蛋白的形態(tài)結構、調控機制以及與心肌功能的關系已引起國內外學者的關注。研究發(fā)現(xiàn),WKY-M誘導心臟I型膠原水平升高,說明心臟功能下降。

    BNP是目前診斷心肌病最有效的血清學指標。研究發(fā)現(xiàn),與WKY-C組相比,WKY-M組血清BNP升高。同時,WKY-M組心肌組織壞死面積明顯增大。血清心肌酶的測定對心肌病的診斷和治療評價具有重要價值。ADR導致心肌酶CK、CK-mb、AST和LDH水平升高,與心功能下降結果相一致。WKY-M組心肌病導致血清促炎因子IL-6、TNF-a和抗炎因子IL-10水平升高。提示心肌病可誘導促炎和抗炎因子失衡,從而介導免疫或炎癥反應。

    研究結果顯示,臍血MSCs移植可以改善受損心臟局部和整體的收縮或舒張功能。目前,移植細胞改善心臟功能的機制尚不清楚,其機制可能是臍血間充質干細胞誘導心肌再生和旁分泌效應。

    參考文獻

    [1]韓小改,李建斌,單泓,等.兩種狀態(tài)臍血間充質干細胞移植對腦梗死大鼠神經功能恢復的對比研究[J].中國組織工程研究,2018,22(9):1395-1401.

    [2]柳爽爽,王本臻,毛成剛,等.人臍帶間充質干細胞外泌體對多柔比星致擴張型心肌病大鼠心肌纖維化的影響[J].中華實用兒科臨床雜志,2020,35(11):842-846.

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