一種實(shí)時熒光定量PCR方法鑒定野鳥中禽流感病毒方法的建立

楊國祥 周豪 朱功良 李勇 蔡華銳 張俊 陳婧 陳光 馮偉 陳全姣

摘 要： 為滿足高通量快速檢測野鳥中禽流感病毒的需要，本研究針對A型流感病毒M基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對引物和探針，建立了一種能夠檢測A型禽流感病毒的實(shí)時熒光定量PCR方法，并對該方法的靈敏性、特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，該方法相較于傳統(tǒng)的雞胚分離和RT-PCR方法，具有靈敏度高、特異性好和耗時短等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測野鳥中攜帶的禽流感病毒。

關(guān)鍵詞： 禽流感病毒;野鳥;熒光定量RT-PCR

中圖分類號：S851.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1004-3020（2021）03-0035-05

野生鳥類作為禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的天然宿主，在流感病毒的貯存、傳播和變異中發(fā)揮著重要作用。所有亞型AIV均能從野鳥體內(nèi)分離，它們攜帶病毒，但一般不表現(xiàn)出臨床癥狀，并且可以通過遷徙將流感病毒擴(kuò)散至世界各地。從家禽和哺乳動物體內(nèi)分離到的流感病毒均直接或間接來自野鳥，對家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅，因此建立科學(xué)快速的診斷方法顯得尤其重要。傳統(tǒng)的流感病毒分離鑒定方法面臨著耗時長等缺點(diǎn)，因此建立一種更加快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法來檢測野鳥中攜帶的流感病毒，對于流感病毒的監(jiān)測與預(yù)警顯得尤為重要。實(shí)時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，QPCR）技術(shù)以其快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，重復(fù)性好，全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種病原檢測中。本研究基于A型AIV中高度保守的M基因作為檢測靶點(diǎn)，建立了一種TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR方法，用于檢測野鳥糞便樣本中的流感病毒，既可以作為應(yīng)急檢測技術(shù)應(yīng)對突發(fā)疫情，也可以用于對野鳥攜帶的流感病毒進(jìn)行常規(guī)檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存的兩株禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株H6N1、H9N2雞胚尿囊液各一份。100份野鳥糞便樣本于2020年1月13日在湖北省黃梅縣龍感湖采集，并于-80℃保存。

雞傳染性囊病病毒（IBDV），禽白血病病毒（ALV）來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.1.2 試劑

病毒RNA/DNA提取試劑盒（購自西安天隆科技公司）;DNA Marker DL2000（TAKARA）;HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（Vazyme）;T7 High Yield RNA Transcription Kit（Vazyme）;Endo-Free Plasmid Mini Kit II（Omega）;Gel Extraction Kit（Omega）;MicroElute RNA Clean Up Kit（Omega）。

1.1.3 儀器設(shè)備

熒光定量PCR儀（Bio-RadCFX96）;全自動核酸提取儀（天隆GeneRotex96）;移液器（德國Eppendorf公司）;離心機(jī)（ Eppendorf ）;瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-3ICN）;PCR儀（TProfessional）;漩渦混合器（VORTEX-2）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室野鳥中分離到的流感病毒毒株序列設(shè)計(jì)了多對引物探針，并參考世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO 2014）及中國國家流感中心（Chinese National Influenza Center，CNIC 2011）推薦的多對流感病毒引物和探針序列[7]，通過比較幾組引物和探針之后，從中選擇了一組靈敏度最佳的引物探針。引物、探針均由武漢擎科生物有限公司合成，用無核酶水稀釋至10 umol/L工作濃度，分裝置-20℃保存?zhèn)溆?，引物和探針序列見?。

1.2.2 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

利用HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（Vazyme）試劑盒，以A/Chicken/Hunan/8.27 YYGK3W3/2018（簡稱3W3）毒株核酸為模板對PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，選取ct值最小的反應(yīng)條件。最終確定反應(yīng)體系如下：2X One step Q probe mix，10 μl;One step Q Probe enzyme mix，1 μl;IAV-F（10 umol/L）和IAV-R（10 umol/L），0.4 μl;IAV-P（10 umol/L），0.2 μl;模板RNA 8 μl，總體系20 μl。反應(yīng)條件如下：50℃逆轉(zhuǎn)錄，15 min;95℃預(yù)變性，30 s;95℃，10 s，60℃，30 s，共擴(kuò)增45個循環(huán)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度評價

根據(jù)3W3毒株M片段基因組序列，在其M基因兩端設(shè)計(jì)了一對引物，擴(kuò)增M基因片段全長后克隆至PHW-2000載體T7啟動子下游形成重組質(zhì)粒，導(dǎo)入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，使用Endo-Free Plasmid Mini Kit II（Omega）提取質(zhì)粒并測序鑒定，設(shè)計(jì)了一段包含T7啟動子序列的引物，擴(kuò)增包含T7啟動子及M片段的序列，使用Gel Extraction Kit（Omega）回收目的片段后用T7 High Yield RNA Transcription Kit（Vazyme）合成RNA標(biāo)準(zhǔn)品，用MicroElute RNA Clean Up Kit（Omega）試劑盒純化RNA標(biāo)準(zhǔn)品，隨后用酶標(biāo)儀測定RNA濃度后計(jì)算拷貝數(shù)。將RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋至0.5×1012-0.5×101copies/μl，采用上述反應(yīng)體系和條件對各稀釋度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

將IBDV、ALV、H1N1（PR8）、H5N6、H6N1、H7N9、H9N2（3W3）病毒提核酸后作為模板，用已建立的方法對這些不同病毒的核酸進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測該方法的特異性。

1.2.5 野鳥糞便檢測

用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對2020年1月13日在湖北省黃梅縣龍感湖采集的100份野鳥樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測，野鳥糞便樣本保存于含10%甘油的PBS中（含0.25%的BSA和硫酸慶大霉素，10000U青霉素、20000U鏈霉素）。樣品渦旋混勻后，4℃ 12 000 rpm離心5 min，取200 μl上清用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取核酸后進(jìn)行qPCR檢測，每個樣本設(shè)2個復(fù)孔。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與TaqMan探針的選擇及反應(yīng)體系的確定

將實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的引物探針（M-F190/M-R407/M-P213）擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸系數(shù)R2=0.997，擴(kuò)增效率E=106.13%均滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)范圍（圖1A），但是該引物探針的擴(kuò)增曲線并不滿足標(biāo)準(zhǔn)“S”型曲線，且隨著質(zhì)粒稀釋度的增加，熒光信號強(qiáng)度顯著降低（圖1B），因此不利于后期檢測結(jié)果的判讀。隨后將CNIC（M-F170/M-R250/M-P230）和WHO（M-F780/M-R860/M-P800）推薦的引物和探針進(jìn)行了靈敏度比較，將同一流感病毒核酸分別加入上述兩種引物探針?biāo)涞捏w系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（體系中除了引物探針不同外，其它條件均一致），結(jié)果如圖1C所示，WHO（M-F780/M-R860/M-P800）推薦的引物和探針的擴(kuò)增曲線CT值和熒光強(qiáng)度均優(yōu)于CNIC（M-F170/M-R250/M-P230）所推薦的引物探針。同一模板加入不同量后的擴(kuò)增曲線如圖1D所示，結(jié)果表明，當(dāng)模板加入量為8 μl時，CT值明顯低于5 μl和3 μl的模板投入量，因此確定體系中模板加入量為8 μl。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇WHO推薦的引物和探針（M-F780/M-R860/M-P800）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 特異性評價

為檢測WHO（M-F780/M-R860/M-P800）的特異性，分別用該引物擴(kuò)增IBDV、ALV、H1N1（PR8）、H5N6、H6N1、H7N9、H9N2（3W3）病毒核酸，結(jié)果顯示不同亞型的流感病毒均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而以IBDV及ALV核酸為模板，則未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖2），說明該方法對流感病毒均具有特異性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將3W3病毒株不同稀釋度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，模板濃度為1×1012-1×107copies/μl，每個稀釋度做三個復(fù)孔，擴(kuò)增曲線如圖3所示。由標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = -3.8594x + 51.563，回歸系數(shù)R2=0.9997，擴(kuò)增效率為E=97.45%，擴(kuò)增效率在90%～110%之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建成立。

2.4 引物靈敏度評價

將RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，使用WHO（M-F780/M-R860/M-P800）引物，模板濃度分別為1×1012-1×101 copies/μl，用該方法對每個稀釋度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示最低檢測核酸拷貝數(shù)為100 copies/μl（圖5）。

2.5 野鳥糞便樣本的檢測

將所建立的方法對100份野鳥糞便樣本進(jìn)行檢測，將兩個復(fù)孔CT值均小于40，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本判定為陽性樣本。部分樣本的檢測結(jié)果如圖6所示。100份野鳥樣本中流感病毒核酸陽性樣本數(shù)為14，因此本次采集樣本流感病毒核酸陽性率約為14%。

3 結(jié)論與討論

野鳥禽流感病毒的自然宿主，目前已從25個科100多種野鳥（包括野鴨、大雁、天鵝等）中分離到幾乎所有亞型的禽流感病毒。野鳥的流感監(jiān)測主要采集野鳥糞便，通過傳統(tǒng)的雞胚分離來監(jiān)測禽流感病毒。由于傳統(tǒng)的雞胚分離法需要傳代3次，耗時長且工作強(qiáng)度大，嚴(yán)重限制了野鳥攜帶AIV的監(jiān)測效率。本研究擬在本試驗(yàn)建立一種高通量、靈敏度更高的檢測方法來提高病毒檢測效率。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本研究建立的基于流感病毒M基因的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性，對多種亞型流感病毒均能特異性檢出，而與其它病毒無交叉反應(yīng)，而且該方法可以檢測到最低拷貝數(shù)為1×102 copies/μl的病毒。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，擴(kuò)增效率為97.45%，可對野鳥糞便這類低病毒載量的樣本進(jìn)行定量檢測。

本試驗(yàn)比較了不同引物對AIV的擴(kuò)增效率，發(fā)現(xiàn)WHO網(wǎng)站公布的引物具有較好的擴(kuò)增效率。同時，為使建立的熒光定量RT-PCR技術(shù)可以替代經(jīng)典的雞胚擴(kuò)增法，對該引物的特異性和靈敏性進(jìn)行了進(jìn)一步的測試，對其中的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，方便對糞便中病毒進(jìn)行絕對定量。與傳統(tǒng)的雞胚分離法相比，該方法具有更高的AIV陽性率，滿足替代傳統(tǒng)雞胚分離方法的條件之一。但是否會存在漏檢，即雞胚分離陽性的樣本是否全部為熒光定量RT-PCR技術(shù)陽性，由于測試的樣本只有100份，還需更多數(shù)據(jù)的支撐。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：唐 嵐）