中國(guó)非洲豬瘟疫情概況及其疫苗研究進(jìn)展

崔鈺晨 陳騏

摘 要：非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒引起的豬高致命性傳染病。目前，它被列為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織報(bào)告的法定傳染病和中國(guó)政府規(guī)定的一級(jí)動(dòng)物疾病。自2018年8月爆發(fā)以來，ASF給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中國(guó)ASF防控和根除的形勢(shì)依然嚴(yán)峻，迫切需要安全有效的疫苗。重點(diǎn)分析了中國(guó)ASF疫苗的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，并對(duì)ASF疫苗存在的問題和未來的研究方向進(jìn)行了討論。關(guān)鍵詞：非洲豬瘟;非洲豬瘟病毒;疫苗

中圖分類號(hào)：S 858.28? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：0253-2301（2021）04-0066-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.04.011

Epidemic Situation of African Swine Fever in China and the Research Progress of Its Vaccine

CUI Yu-chen， CHEN Qi*

（South Biomedical Research Center， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： African swine fever （ASF） is a highly fatal infectious disease in pigs caused by African swine fever virus （ASFV）. At present， it is listed as a legal infectious disease reported by the World Organization for Animal Health and a first-level animal disease specified by the Chinese government. Since the outbreak in August of 2018， ASF has brought huge economic losses to the pig industry of China. The situation of ASF prevention， control and eradication in China is still grim and there is an urgent need for the safe and effective vaccines. The current situation and development trend of ASF vaccines in China were analyzed emphatically， and the existing problems and future research directions of ASF vaccine were discussed.

Key words： African swine fever; African swine fever virus; Vaccines

非洲豬瘟（African swine fever， ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）感染野生豬和家豬引起的一種高度傳染性動(dòng)物傳染病，所有品種和年齡均可被感染。急性型ASF起病快，病程短，主要表現(xiàn)為高熱、食欲不振、發(fā)紺、內(nèi)臟大出血，死亡率接近100%[1-2]。毒性較小的ASFV毒株可導(dǎo)致輕微的臨床癥狀，亞急性形式的疾病，甚至慢性感染[3]。ASFV主要侵染單核、吞噬細(xì)胞（單核、巨噬細(xì)胞）;而病毒對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)是致病和免疫逃避機(jī)制的關(guān)鍵[4]。

目前，ASF尚未得到有效控制，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。由于目前還沒有針對(duì)ASF的商業(yè)化疫苗，該病的控制只能靠早期發(fā)現(xiàn)、有效診斷、撲殺受感染和暴露的動(dòng)物以及嚴(yán)格的衛(wèi)生措施。對(duì)ASF的流行率、傳播機(jī)制和致病性缺乏深入了解，給我國(guó)防治ASF帶來了很大困難。本文結(jié)合當(dāng)前中國(guó)ASF的流行情況介紹了ASF疫苗的最新進(jìn)展和新出現(xiàn)的方法設(shè)計(jì)，以期為ASF疫苗的研發(fā)提供有用信息。

1 中國(guó)ASF疫情概況

ASF一直被列為我國(guó)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的外來動(dòng)物疾病。2018年7月1日至8月1日，遼寧省沈陽市沈北區(qū)某豬場(chǎng)383頭豬死亡47頭。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)進(jìn)行的尸檢分析顯示[5]，豬脾臟出現(xiàn)極度腫脹和嚴(yán)重壞死，是典型的ASF病變。其他病理改變包括扁桃體和肺出血，下頜骨和腸系膜淋巴結(jié)的大理石樣病變，胃漿膜大部分彌漫性出血。2018年，Zhou等[6]通過p72基因片段發(fā)現(xiàn)，我國(guó)首次診斷的ASFVSY18毒株屬于Ⅱ型群，與格魯吉亞、俄羅斯和愛沙尼亞分離出的毒株具有100%核酸同源性，說明這些毒株之間關(guān)系密切。

2021年3月，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部報(bào)告了云南、四川、湖北三地發(fā)生的ASF疫情（均為外省違規(guī)調(diào)運(yùn)）。我國(guó)ASF疫情流行趨勢(shì)已由前期的集中爆發(fā)、發(fā)病快、死亡率高的急性傳播特點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)為目前零星發(fā)生、臨床癥狀不明顯、死亡率降低等特點(diǎn)。張艷艷等[7]的最新研究表明，在其實(shí)驗(yàn)室分離出的來自湖北的ASFV中出現(xiàn)了1株自然變異毒株。該毒株CD2v基因和8CR基因出現(xiàn)了共計(jì)1252 bp的缺失。該變異毒株應(yīng)為我國(guó)境內(nèi)首次出現(xiàn)和鑒定的無紅細(xì)胞吸附活性及毒力可能致弱的自然變異株。Sun及其小組成員[8]在實(shí)驗(yàn)室中共分離到22個(gè)毒株，均為Ⅱ型ASFV。與中國(guó)的索引株HLJ/18相比，所有新分離出的毒株都發(fā)生了突變、缺失、插入或短片段替換。在選出4個(gè)新毒株進(jìn)行毒力測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中2株與HLJ/18一樣高致死;而另外2株在豬群中表現(xiàn)出較低的毒力和較高的傳播力。低毒力的天然突變體的出現(xiàn)給早期發(fā)現(xiàn)帶來了更大的困難，也為ASF的控制提出了新的挑戰(zhàn)。這些變異很可能與我國(guó)ASF疫情逐漸呈現(xiàn)亞急性癥狀有關(guān)，同時(shí)也使得ASFV的傳播力更強(qiáng)、傳播更加隱蔽不易察覺，從而引起更大范圍的擴(kuò)散。

ASF疫情的發(fā)生使中國(guó)生豬生產(chǎn)能力遭受了相當(dāng)大的損失，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的打擊[9]。由于ASFV傳播的隱蔽性和復(fù)雜性，中國(guó)的疫情形勢(shì)仍然嚴(yán)峻。ASF在中國(guó)流行的影響因素主要有：ASFV在環(huán)境中的抗逆性強(qiáng)、ASFV的傳播方式復(fù)雜多樣、人類活動(dòng)對(duì)ASFV傳播的推動(dòng)作用、病豬養(yǎng)殖場(chǎng)傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式等。

2 ASF病毒疫苗的研制現(xiàn)狀

雖然早在20世紀(jì)初就發(fā)現(xiàn)了ASFV，但疫苗的研究卻落后了40余年，這可能與ASFV龐大而復(fù)雜的基因組表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性有關(guān)。到目前為止，宿主保護(hù)反應(yīng)的確切機(jī)制尚未完全確定，保護(hù)抗原仍有待鑒定，這嚴(yán)重阻礙了疫苗的研制。

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗是由致病微生物制成的，這些微生物通過物理、化學(xué)或輻射過程喪失或減弱了其感染能力，而又不損害微生物劑的抗原性[10]。為了克服較弱的免疫反應(yīng)，一些滅活疫苗經(jīng)常與佐劑一起使用。

20世紀(jì)60年代首次嘗試了ASF滅活疫苗。傳統(tǒng)的物理化學(xué)滅活病毒的方法，如用戊二醛和去污劑處理被ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞（AM）[11]以及用乙酰氮丙啶和縮水甘油醛處理制備的ASF滅活疫苗免疫[12]，均未達(dá)到理想的免疫效果。2014年，在接種二乙烯亞胺（BEI）滅活的ASFV Armenia08毒株與最新的PolygenTM或Emulsigen○R-D佐劑的疫苗接種的仔豬中檢測(cè)到ASFV特異性抗體，但該毒株未能提供保護(hù)，并迅速觀察到急性臨床癥狀[13]。研究表明ASF滅活疫苗作為抗原疫苗，缺乏刺激機(jī)體產(chǎn)生完整細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。因此，ASF滅活疫苗作用有限，不能產(chǎn)生針對(duì)非洲豬瘟強(qiáng)度的有效保護(hù)。

2.2 減毒活疫苗（LAVs）

2.2.1 傳統(tǒng)的減毒活疫苗 經(jīng)連續(xù)傳代減毒的ASFV可以誘導(dǎo)對(duì)親本株的保護(hù)性免疫應(yīng)答。然而，接種自然減毒ASF疫苗的豬通常有許多嚴(yán)重的副作用，如發(fā)熱、流產(chǎn)和慢性或持續(xù)性感染[14]。此外，還有毒力逆轉(zhuǎn)的安全性問題。到目前為止，自然LAVs免疫保護(hù)效果還有待進(jìn)一步闡明。鑒于我國(guó)目前ASF的情況，使用常規(guī)的LAVs應(yīng)謹(jǐn)慎或禁止。如果沒有匹配的技術(shù)和產(chǎn)品來區(qū)分感染或是接種的動(dòng)物，使用自然減毒疫苗在很大程度上不利于ASFV在中國(guó)的根除。

2.2.2 基因缺失疫苗 ASFV通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)來編碼多種蛋白質(zhì)，從而達(dá)到抑制和逃避宿主免疫應(yīng)答[15-16]、干擾先天免疫系統(tǒng)[17-19]、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等作用[18，20-22]，這對(duì)其自我增殖和擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件。通過探索涉及復(fù)制、毒力和免疫逃逸的ASFV編碼基因，可以在減毒和免疫原性之間達(dá)到適當(dāng)?shù)钠胶?，這有助于設(shè)計(jì)合理刪除基因的疫苗。此外，反向遺傳學(xué)、基因編輯、同源重組等技術(shù)為開發(fā)下一代基因缺失疫苗提供了輔助手段，并在短期內(nèi)逐步走向市場(chǎng)。

ASF基因缺失疫苗的安全性對(duì)實(shí)際應(yīng)用至關(guān)重要。因此，研究疫苗的遺傳穩(wěn)定性，確定一定劑量范圍內(nèi)疫苗的安全性和免疫原性是必要的。從近年來基因缺失疫苗的研究來看，雖然大部分缺失ASFV毒力相關(guān)基因的基因缺失疫苗可以提供完全的保護(hù)，但由于毒力殘留，仍然存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。2020年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研究成果顯示[23]，通過刪除中國(guó)株HLJ/2018多基因家族MGF360/505的6個(gè)基因獲得的減毒株HLJ/186GD可保護(hù)豬免受親本強(qiáng)毒株的攻擊。然而，其安全性評(píng)估數(shù)據(jù)表明，HLJ/186GD轉(zhuǎn)化為毒性毒株的風(fēng)險(xiǎn)很高。而進(jìn)一步刪除CD2v基因的HLJ/187GD則消除了這種風(fēng)險(xiǎn)，完全減毒，轉(zhuǎn)化為毒性毒株的風(fēng)險(xiǎn)較低，可以對(duì)豬提供完全的抗致命ASFV的保護(hù)。該HLJ/187GD疫苗株是我國(guó)目前較具前景的候選疫苗株，即將進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，有望在控制ASFV傳播方面發(fā)揮重要作用。

目前，制約ASFV基因缺失疫苗研制的主要因素仍是對(duì)ASFV毒力相關(guān)基因和免疫逃逸機(jī)制的研究不足，以及接種引起的亞臨床癥狀和病毒血癥。一項(xiàng)最新研究表明，通過將傳統(tǒng)的同源重組與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的快速分離和純化缺失毒株的方法，可推動(dòng)ASFV基因功能研究并加快基因缺失疫苗的開發(fā)過程[23]。有理由相信，在明確更多ASFV未知基因生物學(xué)功能的基礎(chǔ)上，可以獲得基因缺失疫苗的最佳組合。

2.3 亞單位疫苗和DNA疫苗

目前，ASF基因工程疫苗，如亞單位疫苗、DNA疫苗，提供了一種副作用少、安全性高的有針對(duì)性的方法。已有研究報(bào)道了幾種ASFV蛋白作為ASF疫苗的主要靶點(diǎn)[24-29]，并檢測(cè)了這些蛋白的免疫保護(hù)能力，包括單個(gè)ASFV抗原靶標(biāo)或多靶點(diǎn)混合疫苗接種。

然而，目前亞單位疫苗中使用的大部分ASFV保護(hù)性抗原不足以對(duì)接種豬提供完全的保護(hù)。總的來說，由于作為抗原的ASFV蛋白很少，即使出現(xiàn)中和抗體，也難以提供有效的免疫保護(hù)[29]。雖然DNA疫苗可以在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)高水平的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答[30-31]，但它們?nèi)匀徊荒芡耆挚箯?qiáng)毒株的挑戰(zhàn)。通過DNA疫苗接種篩選的ASFV編碼基因可能在剖析免疫機(jī)制和參與對(duì)ASFV抗原的保護(hù)方面發(fā)揮重要作用，但要達(dá)到提供有效免疫保護(hù)的目標(biāo)仍有很長(zhǎng)的路要走。

2.4 病毒載體疫苗

大量研究表明，病毒載體疫苗可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性抗體介導(dǎo)的體液免疫和IFN-γ分泌細(xì)胞反應(yīng)，可對(duì)ASFV的攻擊提供部分有效保護(hù)[32-34]。2019年， Lokhandwala等[35]用Ad-ASFV-I聯(lián)合BioMize0226佐劑對(duì)豬進(jìn)行免疫接種后發(fā)現(xiàn)，雖然可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生強(qiáng)烈的ASFV抗原特異性IgG應(yīng)答，但接種后的豬無法抵抗強(qiáng)毒株Georgia 2007/1的挑戰(zhàn)，并出現(xiàn)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答依賴性疾病。此外，在BioMize0226佐劑的存在下，ASFV-II誘導(dǎo)了更高的抗原特異性抗體應(yīng)答，但有8/10的接種豬死于強(qiáng)毒株攻擊。相反，ZTS01制劑誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答更弱，接種后5/9的豬能夠抵抗同種毒株的攻擊，存活豬臨床癥狀輕微，無病毒血癥。這些矛盾的研究結(jié)果表明免疫誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫抗體反應(yīng)并不一定與毒株抵抗力成正比，同時(shí)也反映出不同佐劑可能引起不同的先天免疫反應(yīng)，需要進(jìn)一步的研究和評(píng)估新抗原的有效性并選用適當(dāng)?shù)淖魟35]。

目前，對(duì)ASFV的保護(hù)性和致病性免疫應(yīng)答機(jī)理的了解有限，阻礙了病毒載體疫苗的發(fā)展。免疫過度刺激似乎是影響ASF病程的關(guān)鍵因素，高水平的抗體似乎對(duì)臨床結(jié)果有著不利影響。而是否應(yīng)該把重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到低免疫原性ASFV抗原還有待進(jìn)一步探討。

2.5 單周期病毒疫苗

單周期病毒疫苗是由存在復(fù)制缺陷的病毒在輔助細(xì)胞系中擴(kuò)增、表達(dá)相應(yīng)的缺失蛋白[36]，在復(fù)制缺陷的前提下盡可能保存了病毒完整的免疫原性，因此，是一種安全性較高的新型疫苗。研究單周期病毒疫苗需要篩選出缺失相應(yīng)復(fù)制基因的毒株及穩(wěn)定的細(xì)胞系，目前還沒有取得針對(duì)ASFV單周期病毒疫苗的全面、深入的研究成果，但已在單周期病毒疫苗中選出復(fù)制缺陷型裂谷熱病毒（RVFV）作為RVFV的候選疫苗。該缺陷型RVFV在感染的細(xì)胞中只能進(jìn)行單輪復(fù)制，在不引發(fā)免疫宿主全身感染的前提下提供保護(hù)性免疫[37]。

單周期病毒疫苗與減毒活疫苗相比，前者產(chǎn)生免疫反應(yīng)后不會(huì)發(fā)生排毒和毒力反強(qiáng)等免疫副作用，是一種比較理想的疫苗。

2.6 結(jié)合疫苗接種策略

考慮到亞基疫苗和DNA疫苗都不能提供完全的保護(hù)，研究人員提出了新的疫苗接種策略[25，38]，包括“雞尾酒”疫苗接種和“Prime-Boost”疫苗接種策略等。這些策略可以在感染后迅速產(chǎn)生大量CD8+T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），以便了解誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和CD8+T細(xì)胞在免疫保護(hù)中的關(guān)鍵作用[39-40]。

在近年來的一些疫苗研究挑戰(zhàn)中，免疫介導(dǎo)的ASFV感染和疾病增加，這些ASFV免疫原可能由于影響中和抗體產(chǎn)生的抗體依賴性增強(qiáng)（ADE）而導(dǎo)致更嚴(yán)重的癥狀。什么樣的抗原可以起到保護(hù)作用，如何將抗原定向到特定的呈現(xiàn)途徑，是目前研制ASFV基因工程疫苗急需解決的問題。結(jié)合現(xiàn)有病毒株的多樣性，進(jìn)一步探索ASFV的潛在保護(hù)性抗原和接種疫苗后將觸發(fā)的最佳免疫機(jī)制，使用多種ASFV抗原或抗原片段，佐劑和表達(dá)載體的復(fù)雜制劑是ASFV基因工程疫苗的發(fā)展的新途徑。

3 展望

自2018年8月中國(guó)首次出現(xiàn)ASF以來，疫情在全國(guó)持續(xù)快速蔓延。野豬和軟蜱在中國(guó)的廣泛分布可能使ASFV更容易形成一個(gè)自然的流行焦點(diǎn)。ASFV基因組中可變區(qū)長(zhǎng)度較長(zhǎng)，決定了其發(fā)生自然變異的頻率較高[41]。且ASFV具有較為完備的免疫逃避機(jī)制、傳播方式多樣而復(fù)雜以及養(yǎng)豬業(yè)缺少相應(yīng)的養(yǎng)殖規(guī)范等原因，致使ASF疫情發(fā)生100多年至今仍未產(chǎn)生出有效的商品化疫苗。目前，防控非洲豬瘟最有效的措施是預(yù)防，控制傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感動(dòng)物，然而我國(guó)現(xiàn)在養(yǎng)殖模式多樣、養(yǎng)殖密度高、從業(yè)人員生物安全意識(shí)淡薄，使我國(guó)ASF防控和根除形勢(shì)十分嚴(yán)峻。

基于對(duì)ASF疫苗研究現(xiàn)狀的分析，ASFV疫苗的研制還有很長(zhǎng)的路要走。目前以具有復(fù)制缺陷的單周期病毒疫苗和敲除ASFV毒力基因減毒株開發(fā)的重組減毒活疫苗作為未來的中期及短期候選疫苗前景最為樂觀。但在實(shí)際應(yīng)用前，需要對(duì)候選毒株的毒力返強(qiáng)、不良反應(yīng)、持續(xù)感染等安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行綜合評(píng)估。最重要的是，有關(guān)病毒如何調(diào)節(jié)宿主對(duì)感染的反應(yīng)的基礎(chǔ)研究以及研究病毒編碼蛋白在逃避宿主防御中的作用將有助于開發(fā)下一代重組減毒活疫苗[38]。ASF亞單位疫苗、DNA疫苗和病毒載體疫苗具有巨大的研究潛力，在安全性和診斷技術(shù)上具有很大優(yōu)勢(shì)。然而必須考慮到，雖然這些疫苗可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，但它們很少能對(duì)致命的ASFV毒株提供完全的免疫保護(hù)。

在取得有效的商品化疫苗之前，采取科學(xué)的ASF常態(tài)化防控手段同樣至關(guān)重要。由于ASFV易變異的遺傳學(xué)特征，濫用免疫增強(qiáng)藥物和治療性藥物很有可能會(huì)促進(jìn)變異毒株的產(chǎn)生，同時(shí)還會(huì)掩蓋發(fā)病豬的臨床癥狀增加誤診的幾率，不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制疫情，因此杜絕藥物濫用、加強(qiáng)ASF流行病監(jiān)測(cè)和建立完善的診斷技術(shù)體系，才能從根本上科學(xué)預(yù)防ASF疫情持續(xù)發(fā)展。此外，基于目前我國(guó)已經(jīng)出現(xiàn)致病力減弱但傳播力更強(qiáng)、更不易察覺的自然變異毒株，應(yīng)對(duì)感染該變異毒株的豬群果斷撲殺清除，才能避免變異毒株在更大范圍內(nèi)傳播擴(kuò)散[7]。

現(xiàn)階段，中國(guó)開展了針對(duì)ASFV、疫苗研制、檢測(cè)技術(shù)、流行病學(xué)、特種消毒劑、病媒控制等重大基礎(chǔ)科學(xué)的專項(xiàng)研究，為我國(guó)ASF防控提供了重要的科技支撐。此外，中國(guó)ASF疫苗研發(fā)的階段性成果極大地鼓舞了人民戰(zhàn)勝ASF的信心。正如世界動(dòng)物衛(wèi)生組織關(guān)于ASF情況的報(bào)告所述，應(yīng)鼓勵(lì)區(qū)域間合作，以遏制這一跨界傳播疾病的蔓延。控制ASF將是一場(chǎng)具有挑戰(zhàn)性的長(zhǎng)期戰(zhàn)斗，需要所有國(guó)家和國(guó)際利益相關(guān)者的共同參與和

協(xié)調(diào)。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）