牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和膠體金快速檢測(cè)方法對(duì)比試驗(yàn)

羅鵬飛,王金泉,特列克·庫(kù)拉別克,張 琦

(1新疆阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心,新疆 阿勒泰 836500;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院;3.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所；4新疆阿勒泰地區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所)

牛結(jié)核病主要由牛分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行牛結(jié)核病可以通過病畜傳染給人或其他動(dòng)物世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動(dòng)物疾病。目前,牛結(jié)核病的發(fā)病率在我國(guó)一些省份呈上升趨勢(shì),有的已達(dá)到6%甚至更高的陽(yáng)性檢出率,該病在新疆地區(qū)的發(fā)病率一直都比較高,尤其是在農(nóng)牧區(qū),嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的健康發(fā)展。因此,建立可靠的診斷檢測(cè)技術(shù)對(duì)防控該病至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物及受試血清:阿勒泰地區(qū)從其他地方分批次引進(jìn)的415頭西門塔爾牛,用于牲畜品種改良,集中隔離期間統(tǒng)一由獸醫(yī)人員采集415頭份全血,分離血清待檢。

試驗(yàn)材料:牛結(jié)核MPB70/83抗體檢測(cè)膠體金試紙,購(gòu)自武漢生物科技有限公司, 結(jié)核菌素 (由地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷機(jī)構(gòu)提供),20μL加樣槍、塑料吸頭、酒精棉、游標(biāo)卡尺、注射器、個(gè)人防護(hù)用品等。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(tubculin skin test,TST) 將待檢牛只全部編號(hào)后,在頸側(cè)中部上1/3處剪毛,直徑約10 cm。用游標(biāo)卡尺測(cè)量注射部位中央皮皺厚度,做好記錄。用75%的酒精棉消毒注射部位,然后皮內(nèi)注射0.1mL的結(jié)核菌素原液,注射后局部應(yīng)出現(xiàn)小泡。

皮內(nèi)注射后經(jīng)過72 h判定結(jié)果,觀察注射部位局部有無(wú)紅腫熱痛的炎性反應(yīng),并以游標(biāo)卡尺測(cè)量術(shù)部腫脹區(qū)域(或部位)的大小和皮皺的厚度,做好記錄。在72 h觀察后呈陰性和可疑反應(yīng)的牛須在第1次注射的部位,以同樣的劑量進(jìn)行第二次注射,再經(jīng)過48 h觀察結(jié)果。對(duì)于陰性牛和疑似反應(yīng)牛,于注射96 h和120 h再觀察一次,以防止個(gè)別牛出現(xiàn)較晚的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng),所有結(jié)果全部進(jìn)行記錄。

判定標(biāo)準(zhǔn): (1)陰性反應(yīng)：注射部位無(wú)炎性反應(yīng),皮厚差(指注射PPD前后皮皺測(cè)量厚度的差值)在2 mm以下。(2)疑似陽(yáng)性反應(yīng)：局部炎性反應(yīng)不明顯,皮厚差≥2.0 mm,<4 mm。(3)陽(yáng)性反應(yīng)：局部出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng),皮厚差≥4.0 mm。凡判定為疑似陽(yáng)性反應(yīng)的牛,于第一次檢疫后60 d進(jìn)行復(fù)檢,其結(jié)果仍為可疑,經(jīng)60 d再?gòu)?fù)檢,如仍為疑似反應(yīng),則直接判定為陽(yáng)性。

1.2.2 抗體膠體金檢測(cè)方法 室溫條件下,用加樣槍吸取待檢牛血清,向牛結(jié)核MPB70/83抗體膠體金檢測(cè)試紙條樣品孔滴入1滴,可見在試紙條上出現(xiàn)紅色條帶移動(dòng)。若5min內(nèi)仍未出現(xiàn)條帶移動(dòng),則需要在樣品孔中再次滴入待檢血清1滴,10 min后再觀察,若超過30 min仍未出現(xiàn)結(jié)果,則說(shuō)明操作失敗,應(yīng)更換試紙條重做。若室內(nèi)溫度低于15℃,則應(yīng)相應(yīng)延長(zhǎng)結(jié)果觀察時(shí)間。

判斷標(biāo)準(zhǔn): (1) 陰性：在檢測(cè)試紙條上只出現(xiàn)一條紫紅色參考對(duì)照(Control)帶。(2) 陽(yáng)性：在檢測(cè)試紙條上出現(xiàn)檢測(cè)帶(T)、對(duì)照帶(C)兩條紫紅色條帶。(3) 無(wú)效：檢測(cè)試紙條上未出現(xiàn)任何條帶或沒有出現(xiàn)C條帶。

2 結(jié)果和分析

2.1 結(jié)果

應(yīng)用牛型結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和膠體金快速檢測(cè)方法對(duì)415頭份牛血清樣本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果詳見附表。

表 牛型結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、膠體金快速檢測(cè)結(jié)果

對(duì)415份牛血清樣本用牛結(jié)核MPB70/83抗體膠體金試紙條檢測(cè)牛結(jié)核病,與TST進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,TST陽(yáng)性牛9頭,牛結(jié)核MPB70/83抗體檢測(cè)膠體金試驗(yàn)陽(yáng)性牛7頭,兩組結(jié)果陽(yáng)性符合率為77.8% (7/9) ；TST陰性牛406頭,牛結(jié)核MPB70/83抗體檢測(cè)膠體金試驗(yàn)陰性牛408頭,陰性符合率為99.51% (406/408)。

2.2 結(jié)果分析

結(jié)果顯示,對(duì)牛結(jié)核MPB70/83抗體檢測(cè)膠體金試驗(yàn)和結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,膠體金試紙條檢測(cè)與TST具有一定符合率,采用x2檢驗(yàn)法兩種檢測(cè)方法差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

在實(shí)際應(yīng)用中,牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是國(guó)家動(dòng)物結(jié)核病檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。這種檢測(cè)方法存在的不足是顯而易見的,但這種檢測(cè)方法迄今為止得到了大家的一致公認(rèn)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (OIE)和我國(guó)都將此方法列為牛結(jié)核病檢疫的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。由于牛結(jié)核病非常頑固,檢疫凈化是消滅該病的最有效方法,如果只是采用單一的TST易造成人為誤差可能出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性,無(wú)法對(duì)其做出準(zhǔn)確檢測(cè)。因此,采取多種輔助方法作為檢測(cè)手段,對(duì)于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性具有十分重要的意義,而目前r-干擾素酶聯(lián)免疫試驗(yàn) (ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及膠體金快速檢測(cè)等方法,都可以作為TST的補(bǔ)充檢測(cè)方法,在根除牛結(jié)核病的實(shí)際應(yīng)用中具有一定的發(fā)展前景。但因ELISA或免疫金標(biāo)方法,均因結(jié)核病引發(fā)體液免疫的時(shí)間滯后性,不便于操作,或成本過高等原因,妨礙了其在獸醫(yī)臨床中的推廣應(yīng)用。γ-干擾素 ELISA 可以檢測(cè)早期感染牛只,特異性較高,易于標(biāo)準(zhǔn)化,但γ-干擾素ELISA需在采血后24h內(nèi)檢測(cè),且試劑盒的成本較高,故難以推廣應(yīng)用于臨床。PCR雖然具有高敏感性和強(qiáng)特異性,但需要做好前期的準(zhǔn)備工作,且要滿足較高的試驗(yàn)檢測(cè)要求與條件,故亦難以推廣應(yīng)用于臨床。隨著膠體金快速檢測(cè)技術(shù)臨床應(yīng)用的發(fā)展,進(jìn)一步提高膠體金快速檢測(cè)試驗(yàn)的敏感性、特異性,實(shí)現(xiàn)多元、定量或半定量檢測(cè)或?qū)⒊蔀槲磥?lái)膠體金檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向。

4 結(jié)論

牛型結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是我國(guó)動(dòng)物結(jié)核病檢疫的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),該方法具有操作簡(jiǎn)單,易于掌握,皮試所需實(shí)驗(yàn)條件門檻不高,費(fèi)用比較低,易于推廣的優(yōu)點(diǎn),但缺點(diǎn)是檢疫結(jié)果容易受人為因素影響,耗時(shí)耗力,可出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。由于膠體金快速檢測(cè)試劑盒具有快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏的特點(diǎn),目前已被當(dāng)做一種牛結(jié)核病的輔助診斷方法廣泛應(yīng)用于阿勒泰地區(qū)的邊遠(yuǎn)牧區(qū)、養(yǎng)殖場(chǎng)等一些不具備實(shí)驗(yàn)室條件的基層一線,具有一定的應(yīng)用前景。但因膠體金快速檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴,產(chǎn)品多樣化,加之不同廠家和不同批次產(chǎn)品之間的靈敏度差異顯著的原因,導(dǎo)致其在獸醫(yī)臨床應(yīng)用滯后。

綜合分析,隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的快速發(fā)展,阿勒泰地區(qū)這幾年從疆內(nèi)外引進(jìn)品種畜較為頻繁。尤其是在牛的引進(jìn)渠道上較為廣泛。很多時(shí)候牛只在輸入之前早已患病,成為傳染源是導(dǎo)致牛結(jié)核病流行的重要因素之一。在這樣的一種情況下,牛結(jié)核病疫情逐漸受到當(dāng)?shù)攸h委政府的高度重視,綜合防控措施也在不斷加強(qiáng),病原檢出陽(yáng)性率和檢疫陽(yáng)性率均有了明顯下降。但是,從數(shù)據(jù)分析來(lái)看,輸入性牛結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)還是依然存在的,發(fā)病以奶牛居多,這就需要黨委政府不斷增強(qiáng)防控力量,特別是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部門應(yīng)采取綜合防控措施,嚴(yán)格按照國(guó)家牛結(jié)核病診斷技術(shù)操作規(guī)范進(jìn)行,在條件允許的情況下運(yùn)用多種檢測(cè)方法可有效提高檢測(cè)準(zhǔn)確性,減少誤判,而在生產(chǎn)實(shí)踐中還是應(yīng)堅(jiān)持執(zhí)行嚴(yán)格的隔離制度和嚴(yán)格的檢疫凈化制度,對(duì)檢疫陽(yáng)性牛一律作無(wú)害化處理。