制革固體廢棄物的熱-酶結(jié)合法制備明膠的研究

鄭 翔，高沛汝，秦 夢，王力源

(河北省微生物研究所，河北 保定 071000)

明膠(Gelatin)呈白色或淡黃色，通常是由豬、牛等動物的骨、皮、肌腱或膜等結(jié)締組織的膠原蛋白經(jīng)降解而成。明膠具有原料廣泛，環(huán)?？山到獾戎T多優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“工業(yè)味精”，在食品加工、醫(yī)藥、化妝品、化工等許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[1-2]。

傳統(tǒng)的明膠制備工藝主要包括酸法和堿法，通常使用硫酸、磷酸、石灰、氫氧化鈉或純堿等對明膠生產(chǎn)原料進(jìn)行預(yù)處理，然后在明膠提取和純化過程中需用到大量的水進(jìn)行清洗及溶出，然后再將水排除[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)每噸皮明膠傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝耗水可達(dá)300t，因此傳統(tǒng)的明膠生產(chǎn)工藝產(chǎn)生了大量的廢水污染[4]。與酸堿法相比，酶法具有周期短、用水少、污染小等優(yōu)點(diǎn)，酶法即用酶處理使膠原溶解并經(jīng)過加熱變性而成為明膠的方法[5]。國內(nèi)外均開展了酶法提取制備明膠的研究，如利用芽孢桿菌蛋白酶水解骨膠原制取明膠[6]，利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶制備牛皮明膠[7]等。雖然對酶法制備明膠的研究進(jìn)行已久，由于酶具有特異性，在制取明膠的過程中酶的種類篩選至關(guān)重要；且由于酶法產(chǎn)率較低、水解反應(yīng)程度較難控制等原因，酶法一直沒有得到大規(guī)模推廣[8]。

本研究采用熱處理與酶水解相結(jié)合的方式處置制革皮廢料制備明膠[9-10]，不僅能夠?qū)χ聘锕腆w廢棄物進(jìn)行清潔化處置，還可對其資源化利用制備明膠[11]。酶法利用廢棄物制備明膠工藝的建立，為制革工業(yè)的綠色發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

牛皮廢料(制革鞣制工藝前裁剪的皮邊角廢料)來自無極景森皮革制品有限公司；胃蛋白酶(3000U/g)購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；中性蛋白酶(5萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g)、酸性脂肪酶(4000U/g)、脂肪酶(4000U/g)、堿性脂肪酶(4000U/g)購自滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker(40～300kDa)購自北京聚合美生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉等購自北京化工廠。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

蛋白電泳儀(君意公司)；凝膠成像儀(天能公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；數(shù)字粘度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 不同制備明膠工藝的比較

采用凱氏定氮法和索氏抽提法分別對牛皮廢料的主要成分進(jìn)行測定。

皮廢料的預(yù)處理：取皮料100g，切成1×3cm2的小條，水洗數(shù)次備用。

皮廢料的水解處理：酸法、堿法、酶法和熱-酶法水解廢料(表1)。其中復(fù)合酶解處理工藝溫度35℃，酶解8h，酶的添加量1020U/g(酶/皮重=1%)。

表1 不同制備明膠工藝的比較

皮廢料的后處理：在溶液初始pH 5、60℃的條件下提膠7h[12]，之后過濾、濃縮、烘干制成明膠。其中酶處理的廢料在水解工藝后80℃水浴5min酶滅活處理。

2.2 熱-酶結(jié)合法制備明膠的酶解工藝優(yōu)化

將預(yù)處理后的皮廢料放置于燒杯中，加入2倍的蒸餾水，70℃水浴1h。冷卻至室溫備用。

2.2.1 酶制劑種類的篩選

本研究采用的是蛋白酶與脂肪酶混合制成的復(fù)合酶制劑，其中蛋白酶與脂肪酶的酶活比例為50∶1。三種酶制劑組成分別為復(fù)合酶1：胃蛋白酶與酸性脂肪酶，最適pH為3；復(fù)合酶2：中性蛋白酶與脂肪酶，最適pH為7；復(fù)合酶3：堿性蛋白酶與堿性脂肪酶，最適pH為9。分別采用三種復(fù)合酶處置皮廢料，復(fù)合酶的添加量為1%，以產(chǎn)率及明膠粘度為評價指標(biāo)，篩選出最佳復(fù)合酶。

2.2.2 酶解工藝的單因素試驗(yàn)

在篩選到最適的酶制劑種類后，對酶解反應(yīng)過程中應(yīng)控制溫度、時間、加酶量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以便發(fā)揮酶的最佳催化活性，同時保證膠原適度降解。

在酶解溫度35℃，酶解時間8h的條件下，探究不同加酶量0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.5%對制備明膠的影響。

在酶解時間8h，加酶量1.00%的條件下，探究不同酶解溫度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃對制備明膠的影響。

在酶解溫度35℃，加酶量1.00%的條件下，探究不同酶解時間4h、6h、8h、10h、12h對制備明膠的影響。

2.2.3 酶解工藝的正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以產(chǎn)率和粘度為評價指標(biāo)，以酶解溫度、酶解時間、加酶量為影響因素，每個因素取三水平，選用L9(34)正交試驗(yàn)對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 酶解工藝正交試驗(yàn)因素水平表

2.3 熱-酶法制備明膠的后處理

將酶解工藝的皮廢料進(jìn)行酶滅活處理后，在pH 5、60℃的條件下提膠7h，將酶解所引起的化學(xué)變化顯示出來，溶出膠原蛋白分子的三角螺旋結(jié)構(gòu)而成為明膠溶液。然后采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在真空度-0.1MPa，加熱溫度70℃，轉(zhuǎn)速80r/min的條件下濃縮明膠溶液。膠液濃縮后通過干燥、粉碎即可獲得明膠。

2.4 明膠性狀的感官評價及成分測定

產(chǎn)率的測定：明膠產(chǎn)率=(明膠干重/生皮質(zhì)量)×100%

粘度測定：明膠的粘度是明膠應(yīng)用的重要指標(biāo)，將配置成6.67%的溶液，在60℃條件下采用數(shù)字粘度計(jì)對明膠粘度進(jìn)行測定。

分子量測定：配制成2%的明膠溶液用SDS-PAGE方法測量明膠分子量。

依據(jù)GB 6783—2013《國家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 明膠》對明膠的性狀進(jìn)行評定，同時依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)對明膠的水分和重金屬含量進(jìn)行測定。

3 結(jié)果與分析

對制革鞣制前的牛皮邊角廢料的成分進(jìn)行分析測定，發(fā)現(xiàn)其含有的主要成分為水、粗蛋白和粗脂肪，如表3所示。其中粗蛋白含量為20%-25%，是其最有價值的組分，后續(xù)對其蛋白組分進(jìn)行再利用。

表3 牛皮原料中主要成分的含量

3.1 不同制備方法對明膠的影響

本試驗(yàn)分別采用酸法、堿法、酶法、熱—酶法制備明膠，比較所得明膠的產(chǎn)率及粘度結(jié)果如表4所示。使用酸法制備明膠，產(chǎn)率最高；使用堿法制備明膠，所得明膠粘度最大；而酶法制備明膠的產(chǎn)率最低，明膠粘度介于酸法和堿法之間。酶法制備明膠的產(chǎn)率較低是限制酶法推廣的重要原因。熱—酶法與酶法相比，明膠產(chǎn)率及粘度均有提高。因此，選用熱—酶法對制備明膠的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高明膠的產(chǎn)率和粘度。

表4 不同制備明膠方法的比較

3.2 熱-酶法結(jié)合制備食用明膠工藝優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 酶種類的篩選結(jié)果

分別用三種復(fù)合酶按照酶解及后處理工藝制備明膠，所得明膠的產(chǎn)率和粘度如表5所示。復(fù)合酶3與復(fù)合酶1、2相比，在明膠產(chǎn)率和粘度上均最高。因此，選用復(fù)合酶3，即堿性蛋白酶與堿性脂肪酶應(yīng)用在明膠制備工藝中。

表5 不同復(fù)合酶對制備明膠的影響

3.2.2 加酶量對制備明膠的影響

不同酶添加量對明膠的產(chǎn)率和粘度的影響結(jié)果見圖1，當(dāng)?shù)孜餄舛燃磁ＦU料的量在一定范圍內(nèi)，酶解反應(yīng)速率和酶濃度成正比，在加酶量為1.25%時，明膠的產(chǎn)率和粘度均達(dá)到最大值。

圖1 加酶量對制備明膠質(zhì)量的影響

3.2.3 酶解溫度對制備明膠的影響

由圖2可知當(dāng)酶解溫度為45℃時，明膠產(chǎn)率和粘度均最大。表明在此溫度下，復(fù)合酶對牛皮的降解效果最好。而溫度較高時，酶容易將膠原降解為短鏈，酶解結(jié)束后被水洗掉，造成明膠產(chǎn)率和粘度的降低。

圖2 酶解溫度對制備明膠的影響

3.2.4 酶解時間對制備明膠的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解時間小于8h時，明膠的產(chǎn)率隨著酶解時間的延長而增加，隨后明膠的產(chǎn)率逐漸降低。這主要是因?yàn)槊附夥磻?yīng)過長，膠原主鏈被降解，而斷裂的肽鍵在水洗時會流失，明膠粘度主要和分子鏈的長短有關(guān)，分子鏈越短，其溶液的粘度也就越低。

圖3 酶解時間對制備明膠的影響

3.2.5 酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以產(chǎn)率和粘度為評價指標(biāo)，以酶解溫度、酶解時間、加酶量為影響因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 酶解工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

酶解時間、酶解溫度、加酶量均為影響明膠的重要因素。由極差分析結(jié)果可知，在酶解反應(yīng)過程中，3個因素對制備明膠影響的主次順序?yàn)椋好附鈺r間>加酶量>酶解溫度。最佳酶解反應(yīng)條件為A3B2C1，即酶解時間10 h、酶解溫度45℃、加酶量1.00%。

3.2.6 后處理加工

采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去水分，濃縮膠液后再通過干燥、粉碎等步驟即可獲得明膠制品。

圖4 明膠固體制品

3.3 明膠的各項(xiàng)指標(biāo)測定

3.3.1 明膠產(chǎn)率、粘度計(jì)分子量測定

經(jīng)測定固體明膠與生皮質(zhì)量得出明膠產(chǎn)率為21.87%，明膠的粘度為3.65mPa·s。天然膠原由三條左手螺旋結(jié)構(gòu)的單肽鏈相互纏繞形成右手超螺旋結(jié)構(gòu)，其中單鏈(α 鏈)的分子量大約為1.0×105g/mol。隨著動物年齡的老化，膠原鏈間會發(fā)生交聯(lián)，最終以 β 鏈(兩條交聯(lián)肽鏈)或 γ 鏈(三條交聯(lián)肽鏈)，甚至分子量更高的組分形式存在。采用SDS-PAGE方法測量明膠分子量結(jié)果如圖5所示。在100kDa處有兩條明顯的條帶，說明所制得明膠的 α 鏈含量較高；在180kDa和300kDa處，也有條帶存在但不明顯，說明所制得明膠的 β 鏈、γ 鏈含量較低。

圖5 明膠分子量分布情況

3.3.2 明膠感官指標(biāo)評定和理化性質(zhì)測定

依據(jù)《國家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 明膠》(GB 6783—2013)對明膠進(jìn)行感官評定同時對各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行測定。試驗(yàn)結(jié)果如表7、表8所示。

表7 明膠的感官指標(biāo)

表8 明膠的各項(xiàng)理化指標(biāo)

4 結(jié)論

通過對不同制備明膠方法的比較，選擇熱—酶法處置制革生皮邊角廢料制備明膠。此法屬于清潔化方法，而且與未經(jīng)熱處理的酶法相比，在明膠產(chǎn)率和粘度上均有提高。本試驗(yàn)得出制備明膠的最佳工藝為：牛皮邊角料70℃熱處理1h；添加1.00%的含有堿性蛋白酶與堿性脂肪酶的復(fù)合酶，在45℃的條件下酶解10h；之后在80℃的條件下酶滅活處理5min；提膠條件為在溶液初始pH 5、60℃的條件下提膠7h；最終經(jīng)分離、濃縮、干燥、粉碎等處理后制得明膠。經(jīng)測定明膠的粘度為3.65mPa·s，灰分含量為0.72%，含水量為12.20%，凝膠強(qiáng)度為86Bloom g，水不溶物含量為0.16%。熱-酶法處置制革固廢制備明膠工藝的建立，不僅能提升固廢的清潔化處理水平還能實(shí)現(xiàn)其資源化利用，有利于制革工藝的綠色發(fā)展。