絞股藍(lán)飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李妮勵(lì)，梁永娟，黃千禧，黎 欣，林青華，2*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200)

絞股藍(lán)又名七葉膽，為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的干燥全草[1]，因絞股藍(lán)部分皂苷結(jié)構(gòu)與人參皂苷相似，因而又被稱作“南方人參”[2]。其性寒，味苦、微甘，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有清熱解毒、止咳祛痰、益氣養(yǎng)陰、延緩衰老的功效[3-4]，是廣西地區(qū)壯醫(yī)、瑤醫(yī)的習(xí)用品種。現(xiàn)代研究[5-7]表明，絞股藍(lán)含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸等多種化學(xué)成分，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等多種藥理活性，臨床常用于治療糖尿病、慢性支氣管炎、腎盂腎炎等多種疾病[8-10]。

絞股藍(lán)始載于《救荒本草》[11]，現(xiàn)被廣西、天津、上海、浙江、安徽、福建、江西、湖南、四川等地的中藥飲片炮制規(guī)范收載[12]。但絞股藍(lán)在《廣西壯族自治區(qū)中藥飲片炮制規(guī)范》(2007年版)及《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：第一卷》中僅有性狀特征和莖橫切面顯微特征的描述，再無其他質(zhì)量要求。這不利于絞股藍(lán)飲片的質(zhì)量控制與評價(jià)，如葡萄科植物烏蘞莓Cayratiajaponica(Thunb.) Gagnep的外觀就與其較為相似，肉眼難以區(qū)分，極易混淆[13]，因此對絞股藍(lán)飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)開展研究很有必要，可滿足其質(zhì)量控制與評價(jià)的要求。故本研究根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典：四部》[14](下文稱《藥典》)的相關(guān)規(guī)定，對10批不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)飲片進(jìn)行定性鑒別(性狀、粉末、薄層色譜)與定量研究(水分、灰分、浸出物、含量測定)，以期建立絞股藍(lán)飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其質(zhì)量控制與評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

10批不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室朱意麟老師鑒定為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的干燥全草，見表1。絞股藍(lán)皂苷XLIX對照品(批號MUST-19112910，純度>98.0%)、人參皂苷Rb1對照品(批號MUST-19060116，純度>98.0%)均購于成都曼斯特生物科技有限公司，蘆丁對照品(批號：190328，純度>98.0%)、槲皮素對照品(批號：190331，純度>98.0%)均購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

表1 10批絞股藍(lán)藥材編號與來源

1.2 儀器

LC-2030 Plus高效液相色譜儀(日本島津公司)，Ultimate?XB-C18色譜柱(月旭科技(上海)股份有限公司)，色譜乙腈(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，Direct-Q5UV超純水儀一體機(jī)(廣西南寧博美生物科技有限公司)，KQ-500E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，硅膠G板(青島海洋化工有限公司)，磷酸、甲醇為分析純。

2 方法

2.1 性狀鑒別

10批絞股藍(lán)藥材噴淋適量清水軟化，切成長度為1 cm的段，干燥；按《藥典》通則“0212藥材和飲片檢定方法”對飲片形狀、大小、顏色、表面、質(zhì)地、斷面及氣味進(jìn)行描述。

2.2 顯微鑒別

2.3 薄層色譜鑒別

取絞股藍(lán)飲片粉末(過五號篩)2 g，加80%的甲醇40 mL，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0%甲醇2 mL溶解，即得供試品溶液；取蘆丁和槲皮素對照品各1 mg，分別加80%的甲醇制成每1 mL含0.1 mg的蘆丁對照品溶液及槲皮素對照品溶液，備用。

按照《藥典》通則“0502薄層色譜法”規(guī)定，吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴3% AlCl3乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置365 nm紫外燈下觀察。

2.4 水分、灰分和浸出物的測定

按照《藥典》通則“0832水分測定法(烘干法)”“2302灰分測定法”“2201浸出物測定法(水溶性浸出物，熱浸法)”的要求，分別對絞股藍(lán)飲片的水分、總灰分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物進(jìn)行測定。

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 取絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含絞股藍(lán)皂苷XLIX 0.131 mg及人參皂苷Rb10.099 mg的混合溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備 取絞股藍(lán)飲片粉末(過五號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，密塞，稱定重量，放置30 min，時(shí)時(shí)振搖；超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，精密移取續(xù)濾液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 Ultimate?XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～5 min，20% A；5～15 min，20%～40% A；15～20 min，40% A，20～21 min，40%～20% A；21～35 min，20% A)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波203 nm。

2.5.4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察：精密吸取0.125 mL、0.50 mL、3 mL、4 mL、6 mL “2.5.1”項(xiàng)下的對照品溶液分別置10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液置液相小瓶中，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件依次吸取10 μL進(jìn)樣分析，并以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，分別計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的回歸方程及線性范圍。

精密度考察：取“2.5.4”項(xiàng)下的同一濃度對照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按峰面積計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的相對準(zhǔn)偏差(RSD)。

魯迅“從這搏斗的危險(xiǎn)、緊張、艱難中感到活躍的生命力、感到生活的充實(shí)，產(chǎn)生唯有斗士才能體驗(yàn)的幸福感?！盵4]160他認(rèn)為“死者倘不埋在活人的心中，那就真真死掉了”。[7]280“唯獨(dú)革命家，無論他生或死，都能給大家以幸福。”[9]410正如馮雪峰在《魯迅回憶》中說“現(xiàn)實(shí)戰(zhàn)斗的意志、需要和目的，決定著和統(tǒng)一著魯迅先生的全部思想”。真誠、抗?fàn)幍娜松鷳B(tài)度，斗士的生存方式和價(jià)值取向，使魯迅的散文體現(xiàn)出冷峻剛毅的風(fēng)格。

重復(fù)性試驗(yàn)：取JGL-20190623號絞股藍(lán)樣品按“2.5.2”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并按峰面積計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取JGL-20190623號絞股藍(lán)樣品按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并按峰面積計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的絞股藍(lán)樣品(絞股藍(lán)皂苷XLIX為1.02%、人參皂苷Rb1為0.31%)按“2.5.2”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品，分別向其加入定量的絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1對照品，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣，并計(jì)算絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的回收率及RSD值。

樣品含量測定：取各批絞股藍(lán)飲片，分別按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并分別計(jì)算各樣品中絞股藍(lán)皂苷XLIX及人參皂苷Rb1的含量。

3 結(jié)果

3.1 性狀鑒別

絞股藍(lán)飲片呈不規(guī)則段狀。莖類圓柱形，具細(xì)縱棱，直徑1～2 mm，表面黃綠色或淡綠色，被短柔毛或近無毛，質(zhì)韌，不易折斷，斷面不平坦，髓部微白；卷須二叉或不分叉，側(cè)生于葉柄基部；葉互生，薄紙質(zhì)或膜質(zhì)，皺縮，易碎落，完整葉片潤濕后展開呈五葉或七葉鳥足狀，小葉呈卵狀長圓形或長圓狀披針形，中央小葉常3～12 cm，寬1.5～4 cm，葉端漸尖，葉基楔形，葉緣鋸齒狀；圓錐花序纖細(xì)；花細(xì)小，常脫落；果實(shí)球形，無毛，直徑約5 mm，成熟時(shí)呈黑色；種子寬卵形，兩面具乳狀凸起。氣微，味苦微甘，嚼之有纖維性。見圖1。

圖1 絞股藍(lán)飲片(A)及其復(fù)葉與果實(shí)[15](B)

3.2 顯微鑒別

絞股藍(lán)飲片粉末為淺綠色。纖維眾多，淺綠色，長約100～400 μm，常單個(gè)散在或聚集成束，呈長梭形，晶鞘纖維易觀察，方晶明顯，散布在纖維中央或兩邊。草酸鈣簇晶散在細(xì)胞中，形似荷花，草酸鈣針晶成束存在。石細(xì)胞類菱形，呈棕黃色，三面增厚，層紋清晰，孔溝明顯，散在或成團(tuán)，有些依附于纖維上。少量表皮可見不定式氣孔，呈開放或閉合狀態(tài)。導(dǎo)管眾多，有具緣紋孔導(dǎo)管及螺旋導(dǎo)管。腺毛、非腺毛隨處可見，腺毛的節(jié)與節(jié)間明顯，形似掃帚，腺頭多破碎不完整；非腺毛呈圓錐形，較細(xì)長，一般為3～14個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，長120～360 nm。晶體散落在基質(zhì)中。淀粉粒較多，呈腎型、人字形、圓形或橢圓形，多為單?；驈?fù)粒。還有少量多糖團(tuán)塊，偶見微量油滴。見圖2。

注：1.草酸鈣簇晶；2.草酸鈣針晶；3.石細(xì)胞；4.氣孔；5.具緣紋孔導(dǎo)管；6.晶鞘纖維；7.纖維；8.非腺毛；9.腺毛；10.晶體；11.油滴；12.淀粉粒；13.多糖團(tuán)塊。

3.3 薄層色譜鑒別

薄層色譜鑒別見圖3。圖3結(jié)果表明，槲皮素對照品、蘆丁對照品分別與各供試品在硅膠G板的相應(yīng)位置上，顯淺綠色熒光斑點(diǎn)，但不同供試品間熒光斑點(diǎn)大小有差異，說明各樣品中槲皮素、蘆丁的含量不同。

注：1～5、8～12為絞股藍(lán)供試品；6.槲皮素對照品；7.蘆丁對照品。

3.4 水分、灰分和浸出物的測定

絞股藍(lán)飲片的水分、灰分及水溶性浸出物的測定結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，絞股藍(lán)飲片的水分含量為9.64%～11.19%，總灰分含量為8.95%～12.84%，酸不溶性灰分含量為0.17%～1.51%，水溶性浸出物的含量為22.21%～32.26%。根據(jù)上限值上浮動(dòng)20%的原則，擬定絞股藍(lán)飲片水分、總灰分和酸不溶性灰分的限量值分別不得超過13.0%、15.0%、2.0%；根據(jù)水溶性浸出物下限值的80%擬定絞股藍(lán)飲片中水溶性浸出物的含量不得低于18.0%。

表2 絞股藍(lán)飲片中水分、總灰分、酸不溶性灰分與水溶性浸出物含量

3.5 含量測定

絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1混合對照品及絞股藍(lán)飲片供試品的高效液相色譜見圖4。

線性關(guān)系考察結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷XLIX及人參皂苷Rb1的回歸方程分別為YXLIX=1 620 741X+ 12 436(r=0.999 6)和YRb1=1 097 240X+ 1 431(r=0.999 4)，說明絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1分別在1.64～78.60 μg/mL、1.24～59.40 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度考察結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值分別為1.64%、1.97%，說明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的平均含量分別為1.02%、0.31%，其RSD值分別為1.48%、1.73%，說明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值分別為1.97%、1.84%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。由加樣回收試驗(yàn)結(jié)果可知，絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1加樣回收率的平均值分別為100.16%、100.21%，其RSD值分別為1.40%、0.95%，見表3。方法學(xué)考察結(jié)果表明，選定的高效液相色譜條件可靠、穩(wěn)定，可用于絞股藍(lán)飲片中絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量測定。

注：1.人參皂苷Rb1；2.絞股藍(lán)皂苷XLIX。

表3 絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

10批絞股藍(lán)飲片中絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量見表4。由表4結(jié)果可知，10批絞股藍(lán)飲片中絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量分別為0.12%～0.98%及0.02%～0.30%。按照含量下限值的80%制訂其限量標(biāo)準(zhǔn)，擬定絞股藍(lán)飲片中絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量分別不得低于0.10%、0.01%。

表4 10批絞股藍(lán)飲片中絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1含量

4 討論

4.1 薄層色譜法

本實(shí)驗(yàn)在薄層色譜鑒別過程中，分別考察了溶劑(甲醇、80%甲醇)和展開劑(乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸、乙酸乙酯-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-水、正丁醇-乙酸乙酯-水、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水)對展開效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用甲醇為溶劑制備的樣品在展開過程中會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，而采用80%甲醇制備樣品則無拖尾現(xiàn)象，故采用80%的甲醇為溶劑制備樣品；在考察的眾多展開劑中，只有以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑時(shí)才能使蘆丁、槲皮素的斑點(diǎn)清晰，故選擇乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)作為展開劑。

4.2 高效液相色譜法

本實(shí)驗(yàn)在高效液相色譜條件的選擇過程中，分別考察了流動(dòng)相(乙腈-純水、乙腈-0.2%磷酸水)、波長(203 nm、210 nm)、柱溫(30 ℃、40 ℃)、提取方法(超聲法、回流法)、提取溶劑(甲醇、80%甲醇)等因素對絞股藍(lán)皂苷XLIX、人參皂苷Rb1分離度及峰面積的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)樣品的最佳提取方式為甲醇超聲提取，流動(dòng)相以乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脫為宜，最佳波長及柱溫分別為203 nm、30 ℃。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所建立的絞股藍(lán)飲片定性、定量研究方法，可為絞股藍(lán)飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。