HPLC法同步測定燙狗脊標準湯劑指紋圖譜及原兒茶酸含量

黃燕明，李雪銀，陳桂生，汪 靜，康志英，2，3

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300；3.廣東香雪南藥發(fā)展有限公司，廣東 肇慶 526600)

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根莖，又稱為百枝、金毛狗脊、茍脊、金扶筋等[1]。狗脊是一味經(jīng)典藥材，歷代沿用，其具有祛風濕、補肝腎、強腰膝的功效，多用于治療風濕痹痛、腰膝酸軟、下肢無力，為骨傷科疾病常用的中藥之一[2]。燙狗脊是狗脊藥材經(jīng)砂燙制后所得飲片。由于狗脊藥材外表覆蓋絨毛，需經(jīng)炮制去毛后使用。標準湯劑是以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，按照臨床湯劑規(guī)范進行煎煮，是廣泛應(yīng)用于臨床的一種用藥形式以及中藥配方顆粒的標準參照物。雖然狗脊使用歷史悠久，但查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，對于其質(zhì)量研究的報道并不多，尤其是指紋圖譜研究[3]。本研究收集15批不同產(chǎn)地的燙狗脊飲片，依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》，分別制備成15批燙狗脊標準湯劑，并建立同步檢測其指紋圖譜及原兒茶酸含量的方法，為燙狗脊標準湯劑的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)[4-6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1260 DAD)；三孔電熱恒溫水箱(DK-80，上海一恒科學儀器有限公司)；百萬分之一天平(Mx5，Mettler Toledo)；十萬分之一天平(XP205DR，Mettler Toledo)，超純水器(Simplicity，美國密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇(飛世爾，批號：190258，色譜級)，冰醋酸(阿拉丁，批號：D190888，色譜級)，乙腈(阿拉丁，批號：193730，色譜級)，甲醇(廣州化學試劑廠，批號：20190501-11，分析純)，冰醋酸(廣州化學試劑產(chǎn)，批號：20180904-2)。

1.3 對照品

原兒茶酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110809-201205)；原兒茶醛(中國食品藥品檢定研究院，批號：110810-201608)；5-羥甲基糠醛(中國食品藥品檢定研究院，批號：111626-201912)。

1.4 樣品

共收集15批燙狗脊飲片，其中9批產(chǎn)自海南省，3批產(chǎn)自廣西，3批產(chǎn)自云南省。樣品經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司高級工程師康志英鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準湯劑制備

取燙狗脊飲片100 g，煎煮2次，第1次加水8倍量，浸泡30 min，煎煮30 min，濾過；第2次加水7倍量，煎煮20 min，濾過，濾液合并，減壓濃縮至生藥濃度約為1∶1(g∶mL)的浸膏，冷凍干燥，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

以乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)為流動相，色譜柱為 Kromasil 100-5-AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為260 nm進行檢測。理論塔板數(shù)按原兒茶酸峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.3 參照物溶液的制備

原兒茶酸對照品溶液：取原兒茶酸對照品適量，精密稱定，加甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。原兒茶醛對照品溶液：取原兒茶醛對照品適量，精密稱定，加甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。狗脊對照藥材溶液：取狗脊對照藥材約1 g，置具塞錐形瓶中，按“供試品溶液制備”項下方法制備。

2.4 供試品溶液的制備

稱取本品粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液25 mL，加熱回流30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 15批燙狗脊標準湯劑檢測結(jié)果

分別取15批燙狗脊標準湯劑按“2.4”項下的供試品制備方法制成供試品溶液，再按“2.2”項下的色譜條件進行檢測。結(jié)果15批燙狗脊標準湯劑色譜峰信息豐富，分離度符合要求，峰型好。其中，7個色譜峰穩(wěn)定呈現(xiàn)，故確定7個峰為燙狗脊標準湯劑指紋圖譜的共有峰。與對照品溶液比對分析，確定峰3為5-羥甲基糠醛，峰6為原兒茶酸，峰7為原兒茶醛峰。同時，計算15批燙狗脊標準湯劑原兒茶酸的含量平均值為1.35 mg·g-1，RSD平均值為1.13%。見圖1。

表1 15批燙狗脊標準湯劑含量

3 指紋圖譜方法學考察

3.1 專屬性試驗

按照色譜條件，精密吸取對照品溶液、供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液記錄原兒茶酸2倍以上采集時間色譜圖，結(jié)果如圖2所示，供試品溶液在5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、原兒茶醛色譜峰相應(yīng)的保留時間檢出色譜峰，陰性溶劑對供試品溶液沒有干擾。

圖2 專屬性試驗結(jié)果

3.2 重復(fù)性試驗

按照“供試品溶液制備”項下平行制備6份樣品，以色譜條件進行重復(fù)性考察，結(jié)果各供試品色譜峰保留時間RSD均在2%以內(nèi)，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版》進行相似度評價，各圖譜共有峰與對照指紋圖相似度均大于0.99，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3 穩(wěn)定性考察

按照供試品制備方法項下制備供試品溶液，照色譜條件分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進行進樣測定，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版》進行相似度評價，各圖譜共有峰與對照指紋圖相似度均大于0.99，表明燙狗脊標準湯劑供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 中間精密度考察

分別考察不同人員、不同日期、不同儀器對精密度的影響，結(jié)果不同影響因素下各指紋圖譜共有峰相對保留時間無明顯變化，表明該方法精密度良好。

3.5 耐用性考察

取同一批燙狗脊標準湯劑供試品溶液，分別考察了不同色譜柱、不同流速，測定燙狗脊標準湯劑指紋圖譜，以3號峰5-羥甲基糠醛峰為參照，各共有峰相對保留時間無明顯變化，表明該方法耐用性好。

4 含量測定方法學考察

4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

精密吸取對照品10 μL，連續(xù)進樣6次，測定，記錄色譜圖，分別計算參照物峰面積及保留時間平均值和RSD值，原兒茶酸對照品溶液的峰面積RSD為1.1%，以及保留時間RSD為 0.6%，表明該方法參照物溶液具有系統(tǒng)適用性。

4.2 線性關(guān)系及其范圍

取原兒茶酸對照品溶液(濃度：56.18 mg·mL-1)，采用自動進樣器分別進樣1 μL、2 μL、5 μL、8 uL、10 μL、15 μL，即進樣量56.18 mg、112.36 mg、280.90 mg、449.44 mg、561.80 mg、842.70 mg，在260 nm下測定，以原兒茶酸峰面積積分值A(chǔ)對原兒茶酸對照品的進樣量C進行回歸分析，其回歸方程為：A=3436.395 28C-0.136 94，相關(guān)系數(shù)r>0.999 9，結(jié)果表明原兒茶酸在56.18 mg～842.70 mg范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

4.3 重復(fù)性試驗

同“3.2”項下進行含量測定，計算原兒茶酸的含量和RSD值，標準湯劑平行制備的6份供試品溶液各峰的相對保留時間RSD值均小于2.0%，原兒茶酸的含量平均值為1.6 mg·g-1，RSD為0.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

4.4 穩(wěn)定性試驗

同“3.3”項下進行含量測定，計算原兒茶酸含量和RSD值。原兒茶酸的平均含量為1.5 mg·g-1，RSD為1.0%，表明該供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.5 加樣回收率

精密稱取已測原兒茶酸含量的狗脊標準湯劑(批號：201903001BT，平均含量為1.6 mg·g-1)適量，平行9份，分別精密加入低、中、高濃度的原兒茶酸對照品，按供試品項下操作，依法測定，計算回收率(見表2)。

表2 燙狗脊標準湯劑含量測定加樣試驗結(jié)果

4.6 中間精密度試驗

同“3.4”項下測定，原兒茶酸的平均含量為1.6 mg·g-1，RSD為1.2%，說明該方法中間精密度良好。

4.7 耐用性試驗

同“3.5”項下測定，原兒茶酸的平均含量為1.5 mg·g-1，RSD為1.6%，說明該方法耐用性良好。

5 討論

通過對狗脊藥材的炮制工藝和化學成分進行調(diào)研分析[7-17]，按本研究色譜方法條件篩選，分別考察流動相系統(tǒng)、供試品提取溶媒和供試品提取方式等因素。流動相系統(tǒng)：流動相1：乙腈-1%冰醋酸溶液(5∶95)，流動相2∶乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)，流動相3：甲醇-1%冰醋酸溶液(12∶88)，流動相4：A甲醇-1%冰醋酸溶液(8∶92)進行檢測，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃。試驗結(jié)果表明，當以流動相為乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)時供試品溶液各色譜峰分離度較好且峰型、色譜峰數(shù)目適宜，確定燙狗脊標準湯劑的流動相為乙腈-1%冰醋酸溶液(3∶97)。

根據(jù)2015版《中國藥典》狗脊“供試品溶液制備”項下，考察甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液、70%甲醇、烯乙醇三種不同溶媒提取效果。結(jié)果以甲醇-1%冰醋酸(70∶30)為提取溶媒提取的色譜圖上峰面積比值較大，因此選用甲醇-1%冰醋酸(70∶30)為溶劑。

另對比考察加熱回流與超聲處理兩種提取方式下供試品溶液各成分含量差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用加熱回流的方式所測得各峰峰面積比值較大，因此本方法采用加熱回流提取方式進行供試品溶液的制備。

綜上所述，本研究建立的燙狗脊標準湯劑同步測定其指紋圖譜及原兒茶酸含量的方法可靠，重現(xiàn)性、準確性好，為燙狗脊配方顆粒質(zhì)量標準研究提供參考依據(jù)。