針眼外敷中藥包質(zhì)量控制研究

譚朝丹，朱建勇，林 愷，李 婷，樓 冰，公丕君，顧偉鷹

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院，上海 200137)

針眼外敷方由決明子、青葙子、密蒙花、金銀花、梔子、赤芍、四季青、川芎、木香、蒲公英、皂角刺、夏枯草、蟬蛻、芒硝、冰片15味中藥組成。前期臨床研究表明，采用針眼外敷中藥包熱敷治療麥粒腫患者，可清熱解毒止痛、祛瘀化膿消腫，臨床療效顯著，安全性較高。為更好地控制中藥包質(zhì)量，制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究特制備了3批針眼外敷包樣品，采用薄層色譜法對針眼外敷包中的君藥決明子、臣藥金銀花、梔子和赤芍進(jìn)行了定性鑒別；采用高效液相色譜法對處方君藥密蒙花中蒙花苷、臣藥梔子中梔子苷及赤芍中的芍藥苷進(jìn)行了含量測定，為制訂針眼外敷包質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地進(jìn)行制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

本研究所用針眼外敷方15味中藥，全部按照2015版《中國藥典》中藥飲片相關(guān)檢測項進(jìn)行鑒別和檢測，經(jīng)檢驗飲片質(zhì)量合格。將飲片打碎，過80目篩，放入高級醫(yī)用無紡布定制的布袋中封口，制成針眼外敷中藥包(批號：20190902，20190904，20190906)，由上?？禈蛩帢I(yè)有限公司制備。

對照品蒙花苷(批號111528-201911)、橙黃決明素(批號111900-201605)、梔子苷(批號110749-201919)、芍藥苷(批號110736-201943)、綠原酸(批號110753-201817)、大黃酚(批號110796-201922)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司，其余為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國安捷倫)；多功能紫外分析儀(BD-II，北京啟航博達(dá))；電子天平(CP225D，北京賽多利斯)；超聲清洗儀(DL720-A，上海之信)；電熱恒溫水浴鍋(HWS28，上海一恒)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV-10，德國IKA)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，鄭州博科)；電熱恒溫干燥箱(DNG-9140A，上海精宏)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 決明子的薄層鑒別 取針眼外敷包粉末5 g，加50%甲醇水溶液50 mL，進(jìn)行索氏提取，收集提取液并濃縮至無醇，加入蒸餾水50 mL，用水飽和正丁醇振搖提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，并揮干，殘渣加甲醇2 mL，加熱溶解，作為供試品溶液。另取橙黃決明素、大黃酚對照品，分別加甲醇，制成1 mg/mL溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗(通則0502)[1-2]，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一GF254硅膠薄層板上，展開劑：石油醚(60～90 ℃)-丙酮(4∶1)，展開，晾干，先置于日光燈下檢視(圖1A)，再置于氨蒸氣中熏蒸(圖1B)。在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯相同顏色的斑點，粉紅色(大黃酚)和亮黃色(橙黃決明素)，陰性未見干擾。

注：1.橙黃決明素對照品；2.大黃酚對照品；3.20190902批；4.缺決明子陰性樣品

2.1.2 金銀花的薄層鑒別 取針眼外敷包粉末5 g，加1%鹽酸水溶液50 mL，超聲30 min，濾過，取濾液，用水飽和正丁醇振搖提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，并揮干，殘渣加甲醇2 mL，加熱溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加50%甲醇，制成1 mg /mL，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗(通則0502)[3-4]，吸取供試品和對照品溶液各5 μL，分別點于同一G254硅膠薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)作為展開劑，展開，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯相同顏色的熒光斑點；而陰性對照未見干擾(圖2)。

注：1.綠原酸對照品；2.20190902批；3.缺金銀花陰性樣品

2.1.3 梔子的薄層鑒別 取針眼外敷包粉末5 g，加50%甲醇水溶液50 mL，索氏提取，收集提取液，濃縮至無醇，再加入蒸餾水50 mL，用水飽和正丁醇振搖提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，并揮干，殘渣加甲醇2 mL，加熱溶解，作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，加甲醇，制成1 mg /mL，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗(通則0502)[5]，吸取供試品溶液和對照品溶液各5 μL，分別點于同一G254硅膠薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)作為展開劑，展開，晾干，先置254 nm紫外光燈下檢視(圖3A)；再噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱(105 ℃)至斑點清晰顯色(圖3B)。在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯相同顏色斑點，陰性未見干擾。

注：1.梔子苷對照品；2.20190902批；3.缺梔子陰性樣品。

2.1.4 赤芍的薄層鑒別 取針眼外敷包粉末5 g，加50%甲醇水溶液 50 mL，索氏提取，收集提取液，濃縮至無醇，再加入蒸餾水50 mL，用水飽和正丁醇振搖提取2次(各50 mL)，合并正丁醇液，揮干，殘渣加甲醇2 mL，加熱溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇，制成1 mg /1 mL，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗[6]，吸取供試品溶液和對照品溶液各5 μL，分別點于同一G254硅膠薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開劑，展開，晾干；再噴以5%香草醛硫酸，加熱(105 ℃)至斑點顯色清晰。在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯相同顏色斑點，而陰性未見干擾，見圖4。

注：1.芍藥苷對照品；2.20190902批；3.缺赤芍陰性樣品。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫ZORBAX Elipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(流動相A)-0.4%磷酸水(流動相B)，洗脫梯度見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：326 nm、238 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取蒙花苷適量，配制成濃度為40 μg/mL甲醇溶液；精密稱取梔子苷和芍藥苷對照品適量，加甲醇，配制成濃度分別為100 μg/mL、100 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取1 g左右針眼外敷包粉末，加80%甲醇溶液25 mL，超聲10 min，放冷后補足體積，采用0.45 μmol/L微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 分別取除密蒙花之外的處方藥材、除梔子和赤芍之外的處方藥材，按照工藝制備成陰性樣品，按“2.2.3”項下方法，分別制備缺密蒙花和缺梔子、赤芍的陰性樣品。

2.3 專屬性實驗

2.3.1 蒙花苷 分別吸取蒙花苷對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項進(jìn)行分析，密蒙花苷與其相鄰峰分離系數(shù)均>1.5，理論塔板數(shù)符合要求，陰性無干擾，專屬性良好，見圖5。

注：A.供試品溶液；B.對照品溶液；C.陰性對照品溶液；1.蒙花苷對照品

2.3.2 梔子苷、芍藥苷 分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項進(jìn)行分析，梔子苷、芍藥苷與其相鄰色譜峰分離系數(shù)均>1.5，理論塔板數(shù)符合要求，陰性無干擾，專屬性良好，見圖6。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取1、1.25、2.5、5、10、12.5 μL蒙花苷對照品溶液，以及梔子苷和芍藥苷混合對照品溶液，注入高效液相色譜儀，按照“2.2.1”項進(jìn)行測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各組分線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和線性范圍。在各自線性范圍內(nèi)，各成分線性關(guān)系良好，見表2。

注：A.供試品溶液；B.對照品溶液；C.陰性對照品溶液；2.梔子苷；3.芍藥苷

表2 三種主成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.2.1”項色譜條件檢測，記錄峰面積，計算RSD值，結(jié)果表明所用方法精密度良好，見表3。

表3 精密度試驗結(jié)果

2.4.3 重復(fù)性試驗 取“2.2.3”項配制的供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣10 μL，分別進(jìn)樣6次，記錄蒙花苷、梔子苷、芍藥苷峰面積，計算RSD值，結(jié)果表明所用方法重復(fù)性良好，見表4。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項配制的供試品溶液，分別在室溫放置0、4、10、16、24、32 h。按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，計算RSD值，結(jié)果見表5，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知指標(biāo)成分含量的20190902批樣品6份，在線性范圍內(nèi)分別加入一定量的蒙花苷、芍藥苷、梔子苷對照品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定含量，結(jié)果表明所用方法回收率良好，見表6。

表6 加樣回收試驗結(jié)果

2.5 樣品的測定

取3批針眼外敷包樣品(批號20190902、20190904、20190906)，按“2.2.3”項下方法制備供試樣品溶液，分別按“2.2.1”項下色譜條件測定蒙花苷、梔子苷、芍藥苷的含量。結(jié)果見表7。

表7 針眼包中蒙花苷、梔子苷和芍藥苷的含量測定結(jié)果

3 討論

根據(jù)眼科古籍《審視瑤函》記載：“土疳之病，俗號偷針，謂睥上生毒也。脾家燥熱，瘀滯難行。微則自然消散，甚則除血流膿?！盵7]治則當(dāng)以清熱解毒、疏散風(fēng)熱，兼顧祛瘀排膿、健脾消腫，據(jù)此擬定“針眼外敷方”，作為醫(yī)院協(xié)定方，用于治療本院眼科麥粒腫患者。全方共15味中藥：決明子、青葙子、密蒙花、金銀花、梔子、赤芍、四季青、川芎、木香、蒲公英、皂角刺、夏枯草、蟬蛻、芒硝、冰片。決明子味甘、苦、微咸，性寒，清肝明目；青葙子味苦，微寒，清肝，明目，退翳；密蒙花味甘，微寒，清熱瀉火，養(yǎng)肝明目，退翳。三藥均歸肝經(jīng)，可清肝熱，肝開竅于目，肝熱則目腫赤生毒，三藥共為君藥，共奏清退肝熱、解毒明目之功，君藥內(nèi)服或外用治療麥粒腫均有文獻(xiàn)記載[8-11]。臣藥四季青、金銀花、梔子、赤芍，清內(nèi)熱、疏風(fēng)熱、瀉火毒，并可涼血活血。川芎、木香、蒲公英、皂角刺、夏枯草、蟬蛻、芒硝共為佐藥，冰片為使藥。將上述針眼外敷方打粉制成中藥包，輔以熱蒸療法，與氧氟沙星眼膏合用治療早期麥粒腫，療效顯著。

本研究針眼包中決明子(君藥)、金銀花(臣藥)、梔子(臣藥)、赤芍(臣藥)的薄層鑒別，主要參考2015 年版《中國藥典》(一部)的方法[12]。在供試品處理上，根據(jù)所測定成分的極性差異采取特殊處理，決明子中的橙黃決明素，大黃酚、梔子中的梔子苷，赤芍中的芍藥苷屬于極性物質(zhì)，先采用50%甲醇提取，再采用水飽和正丁醇萃取，從而進(jìn)行有效分離并鑒別，同時樣品采用相同的處理方法，簡化了薄層鑒別實驗操作。金銀花中的綠原酸屬于酸性物質(zhì)，先用1%鹽酸進(jìn)行提取，再用水飽和正丁醇萃取。鑒別綠原酸、梔子苷和芍藥苷，采用相同的薄層展開劑，結(jié)果分離度好，進(jìn)一步簡化了薄層鑒別流程，且有較強的專屬性。

本研究中蒙花苷(君藥密蒙花指標(biāo)成分)、梔子苷(臣藥梔子指標(biāo)成分)和芍藥苷(臣藥赤芍指標(biāo)成分)的含量測定方法主要參考2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)密蒙花、梔子及赤芍項下含量測定方法[12]及相關(guān)文獻(xiàn)[13]，經(jīng)過對紫外檢測波段調(diào)試，蒙花苷的含量測定采用326 nm波長，而梔子苷和芍藥苷，可混合對照品溶液，采用238 nm波長。最終，1種樣品2個檢測波長，同時測定針眼包中3個主要指標(biāo)性成分，簡便了含量測定方法。

本研究建立了針眼外敷包4種中藥薄層鑒別及其中3種有效成分的含量測定方法，實驗方法簡便可行，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于針眼外敷包的質(zhì)量控制。