牛樟葉水提物對急性酒精性肝損傷的保護作用及其機制研究

張 蓓，余瀟苓，萬永艷，梁學政，徐 宏，覃開羽*

(1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545026；2.浙江中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 杭州 310000)

牛樟分布于中國南部，為臺灣地區(qū)特有樹種，近年來被中國大陸地區(qū)多地引進栽培。其根皮、果、葉均可入藥，但功效略有不同，牛樟葉功效以祛風除濕、止痛、殺蟲為主[1]。現(xiàn)代研究主要以牛樟的無性繁殖、引種栽培、生長特性和分子鑒定為主[2-3]，藥學部分僅見牛樟葉精油成分研究，其他藥理、化學成分尚未見報道[4]。

嗜酒已成為世界性問題，肝臟是酒精代謝的主要器官，也是酒精誘導損傷的主要靶器官[5]，酒精性肝損傷是飲酒導致的肝臟疾病。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，人們生活和工作的壓力也逐漸增大，該類疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并引起消化、循環(huán)、神經(jīng)等系統(tǒng)病變，給人們帶來的危害不容忽視[6]。急性酒精性肝損傷發(fā)病初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，可發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，嚴重影響人們正常生活及工作[7-8]。酒精誘導的氧化應激是造成急性酒精性肝損傷的重要病理基礎之一[9]。本研究以急性酒精性肝損傷為模型，考察牛樟葉水提物(AECL)抗酒精性肝損傷的藥理作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

牛樟葉由柳州市天姿園藝有限公司提供，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院楊柯教授鑒定為牛樟的葉子，標本保存于柳州市中醫(yī)醫(yī)院藥學部標本室。

AECL制備：稱取干燥牛樟葉10 kg，按物料30倍、20 倍、20 倍加水，加熱提取3次，每次3 h，合并3 次濾液，常壓加熱濃縮至流浸膏，分裝，4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆?，流浸? g相當于8.805 g牛樟葉。

實驗動物：KM 小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，清潔級，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2016-0002。動物飼養(yǎng)于溫度(23 ±2) ℃、相對濕度60%～ 65%、12 h 明暗交替環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，標準飼料，自由進食飲水。

聯(lián)苯雙酯滴丸(萬邦德制藥集團股份有限公司，A02180412)；AST 試劑盒(20190807)、ALT 試劑盒(20190807)SOD 試劑盒(20190815)、GSH 試劑盒(20190220)、MDA 試劑盒(20180617)、TG 試劑盒(20190801)、BCA 試劑盒(20190815)均購自南京建成生物研究所。

1.2 實驗儀器

全波長酶標儀(Epoch Biotek 公司，美國)；UV1780-5 紫外分光光度計(島津企業(yè)管理中國有限公司)；島津L600 臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組與給藥

取健康KM小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，按體質(zhì)量隨機分為6組，即正常組(NS)，模型組(NS)，聯(lián)苯雙酯組(200 mg/kg)，AELC高、中、低劑量組(20生藥/kg、10生藥/kg、5 g生藥/kg)。每組10只，聯(lián)苯雙酯組和AECL組按20 mL/kg 給藥容量灌胃給予相應藥物，每日2 次，連續(xù)10 d，正常組和模型組給予等量生理鹽水；末次給藥0.5 h后，除正常組灌胃生理鹽水外，其余各組小鼠按12 mL/kg 灌胃給予牛欄山二鍋頭白酒，隨后禁食不禁水12 h 后，采血、取肝組織進行相應指標檢測。

2.2 觀察指標

肝臟勻漿或血清中ALT、AST、SOD、GSH、MDA、TG的測定嚴格按試劑盒說明書方法進行。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 AECL對酒精誘導急性肝損傷小鼠肝功能的影響

與正常組比較，模型對照組小鼠血清中ALT、AST和TG活性均明顯提高(P<0.05)；與模型對照組比較，牛樟葉水提物高、中劑量組急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性和TG含量顯著降低，兩組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05。

3.2 AECL對酒精誘導急性肝損傷小鼠SOD活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清和肝組織中SOD 活性均明顯降低(P<0.05)；與模型對照組比較，牛樟葉水提物高、中劑組血清中SOD 活性明顯升高，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高劑量能顯著提高急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中SOD 活性(P<0.05)。見圖2。

注：與模型組比較，*P<0.05。

3.3 AECL對酒精誘導急性肝損傷小鼠MDA 水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清和肝組織中MDA 水平均明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，牛樟葉水提物高劑量能顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠血清和肝組織中MDA 水平(P<0.05)。見圖3。

3.4 AECL對酒精誘導急性肝損傷小鼠GSH 水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清和肝組織中GSH 水平均明顯降低，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，牛樟葉水提物高、中劑量組小鼠血清和肝組織中GSH 水平明顯升高(P<0.05)。見圖4。

注：與模型組比較，*P<0.05。

注：與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

酒精性肝損傷是由于過量飲酒引起的肝臟代謝紊亂，主要包括酒精性脂肪肝、灑精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化。ALT和AST水平的變化是臨床上評價肝損傷的重要指標[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，在牛樟葉水提物的高中劑量組的肝功能指標AST和ALT都有明顯改善，說明牛樟葉水提物具有保肝作用。

酒精性氧化應激被認為是酒精性肝病的一個重要致病因素。機體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶(ADH)的催化下大量脫氫氧化，使三羧循環(huán)障礙和脂肪氧化減弱，影響脂肪代謝，致α-磷酸甘油增多而促進甘油三酯(TG)合成，TG是乙醇肝損傷的一個特征指標[11]。在本實驗，牛樟葉水提物處理急性酒精誘導肝損傷小鼠后，血清和肝臟(數(shù)據(jù)尚未報道)中的TG明顯降低，肝損傷顯著改善。乙醇在肝臟氧化產(chǎn)生過多的氧化應激產(chǎn)物如氧自由基等，這些自由基可以激活磷脂酶及脂質(zhì)過氧化反應，降解膜磷脂，改變其通透性和流動性。此外脂質(zhì)過氧化還可影響DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，直接參與對肝臟的損傷[12]。正常情況下，機體內(nèi)存在自身抗氧化防御系統(tǒng)，SOD在清除自由基、維持還原氧化平衡中發(fā)揮著重要作用[13]。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，是抗氧化酶GSH-Px的底物[14]。大量乙醇攝入使抗氧化物質(zhì)耗竭，破壞機體的氧化和抗氧化平衡，引起氧化應激。MDA是主要的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其含量高低可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，可間接反映自由基攻擊機體細胞的嚴重程度[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，牛樟葉水提物預先干預的小鼠，酒精誘導肝損傷后，與模型組相比，無論是血清還是肝組織中SOD的活性和GSH含量均明顯提高，MDA含量明顯降低，機體抗氧化能力顯著增強。

綜上所述，牛樟葉水提物可降低急性酒精性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST及TG水平，牛樟葉水提取具有明顯的保肝作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，牛樟葉可降低急性酒精性肝損傷模型小鼠肝組織中MDA含量，增強SOD活性和GSH含量，說明牛樟葉水提物可以增強機體清除自由基能力。牛樟葉的保肝作用可能與其增強機體抗氧化能力有關，具體機制還需要進一步研究。