活血散結(jié)中藥復(fù)方含藥血漿對(duì)bFGF干預(yù)下兔RPE細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

蔡婭仙，羅 萍，彭 俊，3，李建超，彭 抿，吳權(quán)龍，3*，彭清華

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.長沙縣星沙醫(yī)院，湖南 長沙 413200；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；4.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710000)

由生物學(xué)理論可知，成纖維細(xì)胞生長因子存在不同的異構(gòu)體，由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的bFGF就屬于其中之一，它可在動(dòng)脈硬化灶中起到促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞游走及平滑肌細(xì)胞增殖的作用。另外，bFGF可促進(jìn)新血管形成，修復(fù)損害的內(nèi)皮細(xì)胞[1]。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞無再生能力，細(xì)胞死亡后不是被替換，而是鄰近的細(xì)胞向側(cè)面滑動(dòng)，以填補(bǔ)死亡細(xì)胞遺留下來的空間，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生可能會(huì)導(dǎo)致增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)[2-3]。彭清華教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，運(yùn)用具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)功效之活血散結(jié)中藥復(fù)方治療PVR取得了較好療效，可顯著抑制增殖膜生長，改善眼部視力[4-7]，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)活血散結(jié)中藥復(fù)方含藥血漿[8]對(duì)bFGF干預(yù)下兔RPE細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行了探索，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇8只成年健康青紫藍(lán)兔，無性別限制，體質(zhì)量1.5～2 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供方為上海市松江區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2012-0008；選擇10只成年家兔，無性別限制，體質(zhì)量1.5～2 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2015-0004。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不進(jìn)行特殊喂養(yǎng)，與日常相同，將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度控制在18～26 ℃，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的空氣處于流通狀態(tài)，相對(duì)濕度應(yīng)處于適宜含量，一般為55%左右。實(shí)驗(yàn)前行常規(guī)眼底檢查(裂隙燈、間接眼底鏡)，排除眼內(nèi)外疾患后方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥品及試劑 活血散結(jié)中藥復(fù)方由三七6 g、丹參15 g、鱉甲15 g等藥品組成，飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，所選藥材為同一批次，采用水煎法，分煎2次后混合藥液濃縮至1.025 g/mL生藥濃度，4 ℃下保存。bFGF(美國Sigma公司)；BGJ398(美國Selleck公司)；PBS緩沖液(湖南維世爾公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司 3111)；生物安全柜(美國Thermo公司 1300)；倒置顯微鏡(德國Motic公司 AE31)；低速離心機(jī)(美國Thermo公司 Fresco 17)；酶標(biāo)儀(美國Bio-tek公司 ELX800)；電泳儀(北京六一儀器廠DYY-6C)；掃描儀(日本Canon9000F MarkⅡ)；成像系統(tǒng)(上海Tanon Tanon-5200)。

1.2 方法

1.2.1 兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 首先將青紫藍(lán)兔處死，方法為耳緣靜脈處空氣栓塞法，可借助5 mL注射器，然后摘除眼球，須無菌操作，將角膜、晶狀體及玻璃體去除，用PBS沖洗，一般須進(jìn)行3次，采用酶消化法獲取RPE原代細(xì)胞，將RPE細(xì)胞調(diào)整為(4～5)×104mL-1的密度，接種于25 mL培養(yǎng)瓶，在含5%CO2，濕度為90%的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁鋪滿大部分瓶底即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在新的含5 mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中分配細(xì)胞懸液，一般以1∶2～1∶5的比例進(jìn)行分配，按照(4～5)×104mL-1的密度傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期第2代細(xì)胞，采用Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 活血散結(jié)中藥復(fù)方含藥血漿制備 成年健康家兔10只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A組空白組、B組活血散結(jié)中藥復(fù)方組，每組5只。根據(jù)人與家兔表面積換算方法計(jì)算(人以60 kg體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，家兔以1.6 kg體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn))，活血散結(jié)中藥復(fù)方組臨床等效計(jì)量為5.064 g/(kg·d)。A組灌服蒸餾水，B組灌服活血散結(jié)中藥復(fù)方，每日20 mL/kg，每日2次，共5 d。采血前禁食禁水12 h，末次給藥2 h后，腹腔注射麻醉并將家兔固定后，取腹主動(dòng)脈血于真空采血管內(nèi)，顛倒混勻后靜置、離心，收集上清液。

1.2.3 含藥血漿對(duì)bFGF干預(yù)下兔RPE細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分為正常血漿組、bFGF組、bFGF+BGJ398組、bFGF+含藥血漿組，分別予以DMEM、正常血漿、bFGF(10μg·L-1)、bFGF(10 μg·L-1)+BGJ398(10 μg·L-1)、bFGF(10 μg·L-1)+活血散結(jié)中藥復(fù)方含藥血漿(10%)進(jìn)行干預(yù)。根據(jù)不同分組的干預(yù)方式，加入相應(yīng)干預(yù)因素，48 h后，收樣進(jìn)行Western blot檢測，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。制備PAGE膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、膜封閉及抗體孵育后，行ECL化學(xué)發(fā)光檢測，將膠片進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件IPP 6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

Western blotting檢測結(jié)果表明，bFGF組與正常血漿組比較，Bax蛋白的顯影條帶明顯變淡，Bcl-2蛋白的顯影明顯增強(qiáng)，Bax/Bcl-2下調(diào)，差別均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；bFGF+BGJ398組、bFGF+含藥血漿組與bFGF比較，Bax蛋白的顯影條帶明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白的顯影明顯變淡，Bax/Bcl-2上調(diào)，差別均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；bFGF+含藥血漿組與bFGF+BGJ398組比較，蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

圖1 蛋白表達(dá)

表1 含藥血漿對(duì)bFGF干預(yù)下RPE細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)于增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變無明確記載，其病因病機(jī)尚有待深入研究，根據(jù)該病特點(diǎn)，大致將其歸類在“積聚”范疇，且隸屬于中醫(yī)眼科血證，具有眼科血證中出現(xiàn)的出血期、瘀血期、死血期、干血期的發(fā)展規(guī)律，又因PVR各階段癥狀的差別，也可將增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變劃入“暴盲”及“視瞻昏渺”范圍。臨床研究表明，五臟六腑的功能失調(diào)、氣血瘀滯、外部損傷均可導(dǎo)致視衣失養(yǎng)，根據(jù)患者疾病表現(xiàn)分為不同證型，如氣血瘀滯型、痰濕內(nèi)聚型等，至疾病后期，不同證型可出現(xiàn)相同的轉(zhuǎn)歸，可出現(xiàn)神膏衰損、痰結(jié)血瘀[8]?；钛⒔Y(jié)中藥復(fù)方的臨床功效為活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)，對(duì)于增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變可起到增強(qiáng)視功能的作用。

研究[9]表明，與PVR相關(guān)的FGF為bFGF，bFGF是最早發(fā)現(xiàn)的可刺激成纖維細(xì)胞生長的因子，在PVR形成中起關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)用bFGF干預(yù)RPE細(xì)胞可有效模擬PVR體外模型。bFGF的功能通過位于細(xì)胞膜的酪氨酸激酶受體實(shí)現(xiàn)，酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)可有效抑制FGFRs活性[10]，其中，BGJ398(NVP-BGJ398)可高選擇競爭性抑制FGFR2，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用BGJ398作為活血散結(jié)中藥復(fù)方陽性對(duì)照組對(duì)照性良好。Bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡蛋白，Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白[11]。細(xì)胞凋亡與凋亡蛋白、促凋亡蛋白之間的構(gòu)成比例緊密相關(guān)，這對(duì)“分子開關(guān)”決定了細(xì)胞凋亡的易感性[12]。當(dāng)Bax形成同二聚體時(shí)細(xì)胞凋亡作用為主導(dǎo)，當(dāng)Bax與Bcl-2形成異二聚體時(shí)以抑制細(xì)胞凋亡為主導(dǎo)作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，bFGF對(duì)RPE細(xì)胞凋亡有顯著抑制作用，可抑制Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)。活血散結(jié)中藥復(fù)方含藥血漿可促進(jìn)RPE細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)RPE細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)及Bax/Bcl-2比率上調(diào)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，且與抑制劑作用相當(dāng)。

本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞增殖模型，成功建立了以RPE細(xì)胞增殖為首要因素的PVR體外細(xì)胞模型，通過Western blotting檢測可見，活血散結(jié)中藥復(fù)方促進(jìn)PVR體外模型的RPE細(xì)胞凋亡可能是通過下調(diào)Bcl-2水平，上調(diào)Bax水平，抑制細(xì)胞分化，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，這可能是其治療增生性玻璃體視網(wǎng)膜病的機(jī)制之一。