貴州道地藥材杜仲內(nèi)生真菌的分離及鑒定

陳曉芳， 李明健

(畢節(jié)醫(yī)學高等專科學校， 貴州畢節(jié) 551700)

引言

【研究意義】杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)植物，為我國特有的藥用樹種，是國家二級保護植物[1]。杜仲植株中含有松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、綠原酸、桃葉珊瑚苷、槲皮素、山奈酚等豐富的化學物質(zhì)，在抗菌、抗腫瘤、治療心腦血管疾病、抗衰老、增強免疫力、安胎等方面有藥理活性[2-3]。植物內(nèi)生真菌是指其生活史或生活史中的某個時期生活于健康植物組織或細胞間隙中，而對宿主植株本身沒有明顯病害癥狀的真菌[4]。【前人研究進展】目前，許多研究者已從杜仲內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到與杜仲相似藥效的活性物質(zhì)，如PDG、綠原酸、黃酮類等，這些成分是評價藥用杜仲藥材質(zhì)量的重要指標[5]。道地性是中藥藥材的重要特點，道地藥材離不開其特有的生態(tài)環(huán)境[6]。楊娟等[7]研究表明，杜仲內(nèi)生真菌群落組成與杜仲的活性成分有關(guān)聯(lián)。同一種植物在不同生長環(huán)境，其內(nèi)生真菌的多樣性及生物活性均有差別，作為構(gòu)成植物內(nèi)環(huán)境的重要組分，杜仲內(nèi)生真菌對宿主的生長和代謝產(chǎn)物的積累以及藥材品質(zhì)等方面均產(chǎn)生較大影響[8]。作為道地性藥材，不同產(chǎn)地杜仲品質(zhì)不一，而貴州的杜仲品質(zhì)好，這與作為杜仲內(nèi)環(huán)境的菌落結(jié)構(gòu)有著不可分割的聯(lián)系?？祩髦镜萚9]研究表明，貴州最適宜種植和生長杜仲的區(qū)域是畢節(jié)市、大方縣等地?！狙芯壳腥朦c】為更好的開發(fā)利用貴州杜仲內(nèi)生真菌資源，目前亟需要解決杜仲與內(nèi)生真菌相互關(guān)系、真菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的機制等方面的問題?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用傳統(tǒng)組織培養(yǎng)法對貴州采自畢節(jié)市和大方縣道地藥材杜仲進行內(nèi)生真菌的分離及鑒定，旨在開發(fā)有地域特色的杜仲內(nèi)生真菌資源，為杜仲內(nèi)生真菌多樣性和內(nèi)生真菌的開發(fā)利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物來源 杜仲樣本采集自畢節(jié)七星關(guān)區(qū)和大方縣，選取離地面2 m以上的無病斑新鮮的杜仲枝條，用無菌水反復(fù)沖洗干凈，晾干備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基來自北京奧博星生物技術(shù)有限公司(貨號02-023)。青霉素-鏈霉素溶液來自biosharp生物科技公司，有效成分為1 mL含100 000單位青霉素和10 mg鏈霉素，稀釋100倍使用。

1.2 內(nèi)生真菌的分離

內(nèi)生真菌分離采用組織塊培養(yǎng)法。將表面處理干凈的杜仲枝條放在無菌超凈臺上切段約5 cm，放入75%的醫(yī)用酒精浸泡3 min，取出后依次用裝有無菌水的3個滅菌小燒杯中清洗，然后用無菌水流水沖洗，滅菌濾紙吸干水分。無菌解剖刀剝?nèi)ブl兩端部分和中間的木質(zhì)部，取韌皮部將其切成5 mm2的組織塊。在每個PDA培養(yǎng)基平皿(含青霉素-鏈霉素)上分開放置2個組織塊倒扣于28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d。

對照試驗：1)漂洗液檢驗法。取最后一次沖洗杜仲枝條的無菌水涂布于PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。2)組織印跡法。將上述表面滅菌處理的完整枝條壓入PDA培養(yǎng)基中，使枝條滅菌表面與培養(yǎng)基接觸30 min后，移除植物材料，培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。觀察有無菌落產(chǎn)生，以確保杜仲材料表面滅菌徹底，分離出的真菌為內(nèi)生真菌。

1.3 內(nèi)生真菌的純化、保存

杜仲組織塊培養(yǎng)后每天觀察，當發(fā)現(xiàn)塊莖切口處長出菌絲時，立即將菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上相同條件下恒溫培養(yǎng)。在分離過程中根據(jù)組織塊切口旁長出的菌落形態(tài)、顏色差異及生長時間等不同，分別挑取菌落邊緣的菌絲至新PDA平板上進行分離培養(yǎng)。后續(xù)采用菌絲頂端純化法進行2～3次的分離純化，得到純化菌株。對純化菌株編號后，轉(zhuǎn)至PDA試管斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，然后放入4℃冰箱保存。

1.4 內(nèi)生菌株的ITS分子鑒定

采用CTAB法提取內(nèi)生真菌基因組DNA。采用在真菌ITS測序通用引物對ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系共20 μL：ddH2O 12.8 μL，10×Buffer 2 μL，模板DNA 1.0 μL，正反向引物(10 μmol/L，ITS1和ITS4)各1.0 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL)0.2 μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物純化后委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。擴增序列用GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫Blast程序進行內(nèi)生真菌ITS序列的相似性比對分析。

1.5 內(nèi)生菌株的形態(tài)學鑒定

將純化菌株用打孔器接種到PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，每日固定時間觀察并記錄菌落生長情況和形態(tài)特征。同時做真菌學插片培養(yǎng)和直接制片的方法觀察真菌菌絲和孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)真菌形態(tài)特征參考《真菌鑒定手冊》并結(jié)合真菌ITS序列Blast結(jié)果進行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離鑒定

由表1可見，在畢節(jié)市杜仲中共分離得到內(nèi)生真菌93株。根據(jù)菌株在培養(yǎng)基上生長的速度、菌絲生長狀態(tài)變化、產(chǎn)生的顏色等特征，結(jié)合顯微鏡檢的菌絲結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)等特點，并結(jié)合真菌ITS序列進行分類，共鑒定出擬莖點霉屬、間座殼屬等9屬，杜仲內(nèi)生真菌具有一定的多樣性，其中占絕對優(yōu)勢的種群為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)，分別占54.83%和26.88%，其次為黑附球菌(Epicoccumnigrum)和黑孢屬(Nigrosporasp.)。

表1 杜仲內(nèi)生真菌的形態(tài)特征與分類

2.2 部分內(nèi)生真菌菌落形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征

杜仲內(nèi)生真菌形態(tài)多樣，其中間座殼(Diaporthesp.)，白色短絨毛，菌落中部黑色突起為載孢體，孢子透明，a為含有2個油滴的α型孢子呈紡錘體狀，b為呈線鉤狀的β型孢子(圖1-1)；銳頂炭角菌(Xylariaapiculata)，菌落底層白色長菌毛，表面黑褐色，長出典型的似牙簽的細棒狀子座，粗糙革質(zhì)，尖端白色(圖1-2)；黑附球菌(Epicoccumnigrum)，菌落為鮮艷的粉紅色(圖1-3)；刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)，黑灰色菌落，孢子呈紡錘形或新月形，有或無隔(圖1-4)；黑孢屬(Nigrosporasp.)，白色菌毛發(fā)達，有該菌屬典型的黑而大、圓的孢子(圖1-5)。

注：1為間座殼(Diaporthe sp.)平板形態(tài)(30 d)及孢子(100×)，a為α型孢子，b為β型孢子；2為銳頂炭角菌(Xylaria apiculata)平板特征(30 d)；3為黑附球菌(Epicoccum nigrum)平板特征(15 d)；4為刺盤孢屬(Colletotrichum sp.)平板特征(7 d，30 d)及孢子(40×)；5為黑孢屬(Nigrospora sp.)平板特征(30 d)及孢子(40×)。

3 討論

研究分離得到的杜仲內(nèi)生真菌經(jīng)擬莖點霉屬、間座殼屬等9屬，占絕對優(yōu)勢的種群為擬莖點霉屬，與楊明琰等[10-11]研究結(jié)果均不一致，但梁雪娟[8]采自貴州遵義的杜仲分離得到的內(nèi)生真菌與研究有1個相同點，均為擬莖點霉屬和間座殼屬為優(yōu)勢種群。表明，不同地域的杜仲內(nèi)生真菌在種群結(jié)構(gòu)上存在較大差異，優(yōu)勢菌株組成不同，但是貴州遵義和畢節(jié)的杜仲內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群相同。表明，藥材杜仲的地道性和地理環(huán)境有關(guān)系。

擬莖點霉屬其有性型為間座殼屬，目前已知的有900多種，由于其種類多且不同的生長環(huán)境和不同的寄主導(dǎo)致其在生態(tài)學方面有較大差異。目前，雖對擬莖點霉的生物學特性有較多報道，但至今仍未有該屬生物學特性較一致的描述[12]。李愛華等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的杜仲內(nèi)生真菌擬莖點菌屬菌株。因此，對杜仲內(nèi)生真菌擬莖點霉有進一步研究開發(fā)的價值。

目前，銳頂炭角菌(Xylariaapiculata)、小光殼屬(Leptosphaerulinasp.)和大白栓菌(Trameteslactinea)菌株是從杜仲中分離得到的首次報導(dǎo)小光殼屬菌株國內(nèi)研究極少，僅見該屬中花生焦斑病菌(Leptosphaerulinaarachidicola)的報道[15]。同樣研究極少的是大白栓菌，該菌作為天麻的萌發(fā)菌近年才有相關(guān)研究[16]。銳頂炭角菌為炭角菌屬(xylariasp.)，是一類有重要研究價值的真菌，目前銳頂炭角菌作為石斛內(nèi)生真菌已有相關(guān)的研究報道[17]。這些分離得到數(shù)量較少，相關(guān)研究稀缺且為杜仲內(nèi)生真菌的首次報道，作為杜仲內(nèi)生真菌資源的一部分，具有進一步研究潛力。

另外，研究分離得到3株糞殼球菌屬和4株黑孢屬菌株，CHEN等[18]的研究中鑒定為糞殼菌的杜仲內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生和杜仲藥用成分一致的綠原酸活性物質(zhì)；張維瑞等[19]發(fā)現(xiàn)1株能夠產(chǎn)生綠原酸的杜仲內(nèi)生真菌，經(jīng)分子鑒定隸屬于黑孢屬。其他菌株在杜仲內(nèi)生真菌中均在相關(guān)研究中分離得到。有些菌株不產(chǎn)孢，需結(jié)合分子序列Blast結(jié)果進行鑒定，可能這些菌在PDA平板上不產(chǎn)生孢子，需要特殊的環(huán)境條件才能產(chǎn)孢，也可能在長期與宿主植株共生的過程中，為適應(yīng)環(huán)境在體外培養(yǎng)時不再產(chǎn)孢子或子實體，這些機理需要進一步研究。

4 結(jié)論

試驗在畢節(jié)市杜仲中分離得到的93株杜仲內(nèi)生真菌，經(jīng)生態(tài)學和分子鑒定為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、間座殼屬(DiaportheVsp.)、黑孢屬(Nigrosporasp.)、糞殼菌屬(SordarialesV sp)、黑附球菌(Epicoccumnigrum)、小光殼屬(Leptosphaerulinasp.)、銳頂炭角菌(Xylariaapiculata)、刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)和大白栓菌(Trameteslactinea)共9屬，其中占絕對優(yōu)勢的種群為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)，分別占54.83%和占26.88%，其次為黑附球菌(Epicoccumnigrum)和黑孢屬(Nigrosporasp.)且種群結(jié)構(gòu)特征與目前已有的報道不同，說明杜仲內(nèi)生真菌資源豐富，且杜仲內(nèi)生真菌炭角菌屬、大白栓菌在我國屬于首次報道。