青稞酒大曲微生物的分離鑒定及可培養(yǎng)微生物變化規(guī)律分析

陳占秀，喇錄忠，黃和強(qiáng)，車富紅，祁萬(wàn)軍，孔令武，李善文

（青?；ブ囡乒煞萦邢薰?，青海 互助 810500）

酒曲中含有多種微生物及其產(chǎn)生的復(fù)雜酶系，是中國(guó)白酒釀造必不可少的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑[1]，由于大曲中微生物種類和數(shù)量關(guān)系的不同，在白酒生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物也不同，加上地域、氣候、環(huán)境等條件上的差異，各白酒生產(chǎn)企業(yè)所用大曲中微生物種類及數(shù)量存在較大差異，因而形成了風(fēng)格風(fēng)味迥異的白酒產(chǎn)品[2]。由于大曲中微生物的多樣性，在大曲培養(yǎng)過(guò)程中有霉菌、細(xì)菌、酵母菌、放線菌等微生物，豐富的菌系影響著大曲的質(zhì)量，并進(jìn)一步影響白酒品質(zhì)。

青稞香型大曲白酒采用傳統(tǒng)工藝制成的“白霜滿天星”和“槐瓤曲”作為糖化發(fā)酵劑，精選青稞和豌豆以一定比例混合制曲，更適合釀酒微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，為微生物的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了良好的條件，獨(dú)特的制曲原料和工藝也造就了獨(dú)特的產(chǎn)品風(fēng)格。青稞酒大曲制作和貯存過(guò)程中，微生物隨著時(shí)間的變化，呈不同的變化趨勢(shì)，通過(guò)研究青稞酒大曲培養(yǎng)過(guò)程中微生物數(shù)量變化規(guī)律，可為分析白酒風(fēng)格風(fēng)味提供重要理論依據(jù)。目前，對(duì)大曲中微生物的研究主要分為表型特征鑒定法和基因型鑒定法。表型特征鑒定法是與微生物分離相結(jié)合的，這種方法工作量大，準(zhǔn)確率低，但是能得到活的菌株，利于后續(xù)研究[6]。如Wang 等[16]通過(guò)表型特征鑒定法對(duì)茅臺(tái)大曲中的微生物進(jìn)行了系統(tǒng)的分離鑒定?；蛐丸b定法多是對(duì)樣品進(jìn)行總DNA 的提取之后，通過(guò)對(duì)微生物通用保守序列的比對(duì)，從而可以分析鑒定出樣品中可培養(yǎng)以及不可培養(yǎng)的微生物，具有快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但是多數(shù)得不到活的菌株，不利于后續(xù)深入研究。本文結(jié)合兩種方法，研究了大曲培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌、酵母菌、霉菌及菌落總數(shù)的變化規(guī)律，并對(duì)青稞酒制曲和儲(chǔ)存期的微生物進(jìn)行分離和鑒定，為進(jìn)一步研究青稞酒大曲微生物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：青稞酒制曲期和儲(chǔ)存期大曲，其中對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、8 d、12 d、15 d、21 d 和26 d（出房）樣品進(jìn)行采集。大曲貯存期樣品：同批大曲入庫(kù)后每7 d 取樣1 次，跟蹤取樣6 個(gè)月。每次4 塊大曲，粉碎混合后為1 個(gè)樣品。在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，挑取了22 株細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA 序列測(cè)序與比對(duì)，50 株真菌進(jìn)行ITS1/ITS2 測(cè)序比對(duì)。

試劑：無(wú)水葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、MRS、冰乙酸，國(guó)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；真菌基因組快速提取試劑盒、細(xì)菌基因組快速提取試劑盒、酵母提取物、引物27f、1492r、Tris、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker、dNTP Mixture,10mM、4S Green 核酸染色劑、EDTA 溶液,pH 8.0、瓊脂糖，生工生物工程股份有限公司。

儀器設(shè)備：潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；HYG-B 全溫?fù)u瓶柜，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，泰斯特儀器有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；厭氧工作站、高速冷凍離心機(jī)、梯度PCR 儀、蛋白核酸測(cè)定分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛科技公司；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀，北京六一等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

操作流程：取樣→粉碎混合→菌懸液→傾倒平皿→稀釋涂布平板→培養(yǎng)→平板計(jì)數(shù)→計(jì)算菌落總數(shù)→菌種分離純化→核酸的提取和PCR 擴(kuò)增測(cè)序。

1.2.1 可培養(yǎng)微生物檢測(cè)與菌種分離純化[3]

樣品預(yù)處理：稱取5 g 大曲樣品，放入100 mL滅菌后的0.9%生理鹽水中，30 ℃搖床200 r/min 振蕩10 min。

可培養(yǎng)微生物檢測(cè)：吸取振蕩后的菌懸液100 μL，用0.9%的生理鹽水稀釋到10-1～10-5等不同梯度，分別吸取100 μL 稀釋后的各菌懸液在不同培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：濕度60%，真菌培養(yǎng)基溫度為30 ℃，細(xì)菌培養(yǎng)基溫度為37 ℃，培養(yǎng)48～72 h，厭氧培養(yǎng)操作在厭氧工作站進(jìn)行，菌落計(jì)數(shù)以出現(xiàn)30～300 CFU 細(xì)菌和酵母菌菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，絲狀真菌為10～150 CFU 之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)[7]。觀察記錄菌落信息，挑取平板上形態(tài)特征不同的單菌落，通過(guò)劃線純化，并接種于斜面（4 ℃）保藏和甘油冷凍（-80 ℃）保藏。

1.2.2 核酸提取方法[4]

分離純化的菌株分別進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，酵母菌用YPD 液態(tài)培養(yǎng)基、細(xì)菌用LB 培養(yǎng)基、厭氧菌用PYG 液態(tài)培養(yǎng)基，取2 mL 菌液,加入滅菌后的離心管中，12000 r/min 下以4 ℃、2 min 離心棄上清液收集菌體，用基因組快速提取試劑盒進(jìn)行核酸提取；質(zhì)量檢測(cè)：向離心管中加入30 μL 超純水，溶解核酸；用核酸濃度儀測(cè)定核酸濃度和A260/A280 值（1.8～2.0）。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳檢測(cè)

對(duì)所提取的細(xì)菌基因組DNA 進(jìn)行16S rRNA基因片段擴(kuò)增，采用細(xì)菌16S rRNA 基因的通用引物：正向引物F27（AGAGTTTGATCCTGGCTCA），反向引物R1492（GGTTACCTTGTTACGACTT）；真菌基因片段擴(kuò)增選擇通用引物：NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）；PCR 采用50μL 體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件如表1，反應(yīng)完成后，取3 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲微生物的分離和純化

將分離到的菌株菌落，通過(guò)多次劃線純化挑取，并接種于平板培養(yǎng)基中。經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)特征排重，從青稞酒大曲中總共分離到37 株酵母菌，13 株霉菌及22株細(xì)菌。

2.2 青稞酒大曲微生物的鑒定

2.2.1 青稞酒大曲細(xì)菌的鑒定

在對(duì)分離的22 株細(xì)菌的16S rRNA 基因區(qū)序列進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增并測(cè)序，并將細(xì)菌的16S rRNA基因區(qū)序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST)后，將相似度大于99 %鑒定為同一種，98 %～99 %的鑒定為同一屬，小于98 %的初步鑒定為新種[6]。對(duì)15株細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，其中有12株細(xì)菌鑒定到種，分屬于Staphylococcus succinus，Bacillus atrophaeus，Staphylococcus xylosus，Alcaligenes faecalis，Bacillus subtilis，Klebsiella oxytoca，Pantoea agglomerans，Bacterium strain，Staphylococcus vitulinus，Staphylococcus sciuri，Ochrobactrum pseudintermedium11 個(gè)種，2 株鑒定到屬，為Bacillus sp、Oceanobacillus sp，另外1 株為Cellulosimicrobium funkei。

2.2.2 青稞酒大曲酵母菌的鑒定

選用通用引物，對(duì)分離的37株酵母菌的ITS 基因區(qū)序列進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增并測(cè)序，用NCBI Blast 程序?qū)⑵唇雍蟮?7 株酵母菌序列文件與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到與待測(cè)物種序列相似性最大的物種信息，通過(guò)比對(duì)，相似度大于99%的有10 株共4 種，為Saccharomyces cerevisiae、Meyerozyma guilliermondii、Trichosporon asahii、Wicker-hamomyces anomalus，其余25 株鑒定到屬，分屬于Millerozyma farinosa，Hyphopichia burtonii，Candida fermentati，Saccharomycopsis fibuligera，Pichia fermentans，Issatchenkia orientalis，Cutaneotrichosporon mucoides，Pichia guilliermondii，Exophiala dermatitidis，Kazachstania unispora，Candida anglica，另外有2 株比對(duì)后的相似度只有97 %，初步認(rèn)為是新種。

2.2.3 青稞酒大曲霉菌的鑒定

選用通用引物，對(duì)分離的13株霉菌的ITS 基因區(qū)序列進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增并測(cè)序，并將13 株霉菌序列文件與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，1株鑒定到種，為Penicillium granulatum，其余10 株鑒定到屬，分屬于Penicillium griseofulvum，Aspergillus flavus，F(xiàn)usarium oxysporum，Aspergillus fumigatus，Aspergillus oryzae，Circinella muscae，Lichtheimia corymbifera，Rhizopus，另外兩株相似度為97%，初步認(rèn)為是新種。

2.3 青稞酒大曲制曲期微生物消長(zhǎng)規(guī)律

青稞酒大曲中細(xì)菌數(shù)量最高，其次為酵母菌，霉菌數(shù)量最少，如圖1 所示。微生物數(shù)量前期變化較大，曲心溫度最高時(shí)，細(xì)菌和酵母菌數(shù)量略有降低，除此之外，整體微生物數(shù)量呈上升趨勢(shì)，5 d左右達(dá)到最高后基本趨于穩(wěn)定，出房時(shí)細(xì)菌略有下降。

圖1 青稞酒大曲制曲期微生物數(shù)量變化規(guī)律

2.3.1 細(xì)菌數(shù)量消長(zhǎng)規(guī)律（圖2）

圖2 青稞酒大曲制曲期細(xì)菌數(shù)量變化規(guī)律

由圖2 所示，在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，由于大曲培養(yǎng)方式的開(kāi)放性，各曲房曲存在一定差異，細(xì)菌數(shù)量也存在一定差異，總體規(guī)律表明，細(xì)菌數(shù)量在培養(yǎng)初期快速增加，4～5 d 達(dá)到最大值，后期基本保持平衡，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)略有下降，以均值計(jì)，細(xì)菌總數(shù)為5.5×108個(gè)/g 曲坯，細(xì)菌中Pantoea和Staphylococcus占有很高的優(yōu)勢(shì)，從培養(yǎng)2 d 至培養(yǎng)結(jié)束，Pantoea比例為細(xì)菌總數(shù)的50 %～65 %，Staphylococcus為10%～25%。

2.3.2 酵母數(shù)量消長(zhǎng)規(guī)律（圖3）

圖3 青稞酒大曲制曲期酵母菌數(shù)量變化規(guī)律

因各曲房制曲存在一定差異，酵母菌數(shù)量也存在一定差異，尤其酵母菌受溫度和水分影響大，因此酵母菌差異較大，如圖3 所示，隨著曲房溫度升高，酵母菌在2～5 d內(nèi)快速增長(zhǎng)，后隨著曲房降溫，酵母菌數(shù)量略有降低，在10～15 d 又有增加并達(dá)到最大值，后期基本保持平衡。以均值計(jì)，酵母菌總數(shù)為3.6×107個(gè)/g 曲坯，從第3 天開(kāi)始一直到出房，Saccharomycopsis占有很高的優(yōu)勢(shì)，從2 d時(shí)的20%到5 d 時(shí)快速增加到70%～80%，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)仍占酵母菌總數(shù)的80%，同時(shí)Pichia、Wickerhamomyces也有一定的優(yōu)勢(shì)性。

2.3.3 霉菌數(shù)量消長(zhǎng)規(guī)律（圖4）

圖4 青稞酒大曲制曲期霉菌數(shù)量變化規(guī)律

由于大曲培養(yǎng)方式的開(kāi)放性，各曲房曲存在一定差異，如圖4 所示，總體規(guī)律表明，霉菌數(shù)量在培養(yǎng)過(guò)程中先基本不變，5 d 后開(kāi)始大量繁殖，15 d 左右數(shù)量達(dá)到最高，后期略有降低。這主要由于前期升溫快不利于霉菌繁殖，細(xì)菌和酵母菌數(shù)量急速增加，后期溫度上升減緩，大曲水分適宜霉菌生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)到15 d 時(shí)大曲水分已降到15%以下，不利于霉菌的生長(zhǎng)，霉菌數(shù)量略微下降，以均值計(jì)，霉菌總數(shù)為8.5×106個(gè)/g 曲坯，主要優(yōu)勢(shì)菌為根毛霉屬(Rhizomucor）。

2.4 青稞酒大曲貯存期微生物消長(zhǎng)規(guī)律

青稞酒大曲在培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)過(guò)水分、酸度、糖化力、液化力等理化指標(biāo)檢測(cè)，以及曲香、表面掛霉程度、斷面齊整度、菌絲情況、曲皮等感官指標(biāo)檢驗(yàn)，符合成曲要求的按不同等級(jí)貯存3 個(gè)月以上再進(jìn)行釀酒實(shí)驗(yàn)，貯存環(huán)境要求低溫干燥。隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)，微生物多樣性也在發(fā)生變化，杜海等[11]通過(guò)對(duì)不同貯存時(shí)期大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)3 種大曲相對(duì)豐度靠前的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為乳酸菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、鏈霉菌屬、短桿菌屬等。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，3種大曲的物種多樣性都處于上升趨勢(shì)。

對(duì)青稞酒大曲貯存期微生物進(jìn)行了可培養(yǎng)檢測(cè)，由圖5 可看出，大曲儲(chǔ)存期內(nèi)霉菌數(shù)量持續(xù)降低，細(xì)菌略多于酵母菌，在儲(chǔ)存后期緩慢降低，酵母菌保持穩(wěn)定，因酵母菌中優(yōu)勢(shì)菌為Saccharomycopsis fibuligera，青稞酒釀造車間、大曲車間、曲庫(kù)的環(huán)境中大量存在該菌種；霉菌方面貯存第一個(gè)月Lichtheimia corymbifera比例占5 %～10 %，后期緩慢減少；細(xì)菌可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌貯存前期為Oceanobacillus sp，Pantoe，Staphylococcus等，占細(xì)菌總數(shù)60%左右，后期減少到20%～25%。

圖5 青稞酒大曲貯存期微生物數(shù)量變化規(guī)律

3 結(jié)論

大曲中細(xì)菌、霉菌和酵母菌三者數(shù)量占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，青稞酒大曲也不例外。本研究利用傳統(tǒng)分離方法結(jié)合PCR 測(cè)序技術(shù)，從三大類微生物方面入手，系統(tǒng)分析了青稞酒大曲微生物的群落組成及多樣性。結(jié)果表明，大曲培養(yǎng)期中細(xì)菌數(shù)量最多，第0～5 d 是大曲的培菌期，這個(gè)時(shí)期微生物大量增長(zhǎng)，導(dǎo)致溫度不斷上升，環(huán)境越來(lái)越不適宜微生物的繁殖，3 d 后酵母菌中適宜表面生長(zhǎng)的菌種Saccharomycopsis快速增加到70 %～80 %，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)仍占酵母菌總數(shù)的80%，同時(shí)Wickerhamomyces也有一定的優(yōu)勢(shì)。在整個(gè)大曲培養(yǎng)過(guò)程中Pantoea（泛菌屬）占到絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，從2 d 開(kāi)始增加到50 %，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到70 %，Staphylococcus（葡萄球菌屬）也具有很高的優(yōu)勢(shì)。

本次通過(guò)純培養(yǎng)方法分離青稞酒大曲微生物，分離到22 株細(xì)菌，37 株酵母菌，13 株霉菌。通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，其中有15 株細(xì)菌主要為球菌屬(Staphylococcus)4 株，桿菌屬(Bacillus)3 株，產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）2 株，克雷伯氏菌屬（Klebsiella）2株，泛菌屬（Pantoea）1 株，海洋桿菌屬（Oceanobacillus）1 株；霉菌主要有青霉屬（Penicillium）2 株，曲酶屬（Aspergillus）3 株，鐮刀菌屬(Fusarium)1 株，卷霉屬(Circinella)1 株，橫梗霉屬(Lichtheimia)1 株，毛霉屬（Mucor）1 株，根毛霉屬(Rhizomucor)1 株，根霉屬（Rhizopus）1 株；37 株酵母菌有異常維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）7 株，季也蒙酵母屬（Meyerozyma）1 株，假絲酵母屬（Candida）2 株，有孢圓酵母屬（Torulaspora）1 株，畢赤酵母屬（Pichia）5 株，粉酵母屬（Millerozyma）3 株，絲孢畢赤氏酵母屬(Hyphopichia)4 株，伊薩酵母屬（Issatchenkia）3 株，釀酒酵母屬（Saccharomyces）5 株，覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）1 株，以及4 株Exophiala dermatitidis，1株Kazachstania unispora。

因技術(shù)方法的限制，以往對(duì)大曲微生物群落多樣性的認(rèn)識(shí)僅依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)特征、生理生化特性的分類和鑒定[10]。高通量測(cè)序的應(yīng)用可一次性對(duì)106～108數(shù)量級(jí)的DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，目前在食品發(fā)酵領(lǐng)域被廣泛采用[14]。喬曉梅等[15]擴(kuò)增清香大曲真菌18S V4 區(qū)和ITS 區(qū)后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)米根霉Rhizopusoryzae、傘枝犁頭霉Lichtheimia corymbifera、庫(kù)德畢赤酵母Pichia kudriavzevii和庫(kù)德畢赤酵母Saccharomycopsisfibuligera等為優(yōu)勢(shì)種群[13]。青稞酒大曲也利用高通量測(cè)序解析了大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和組分，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，真菌群落中從第3天開(kāi)始一直到出房，Saccharomycopsis占有很高的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)Pichia、Wickerhamomyces也有一定的優(yōu)勢(shì)性。整個(gè)過(guò)程中Pantoea（泛菌屬）占到絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，Staphylococcus也具有很高的優(yōu)勢(shì)，初步判定青稞酒大曲中優(yōu)勢(shì)菌：細(xì)菌為Pantoea、Staphylococcus，真菌包括Pichia、Saccharomycopsis，除此之外青稞酒大曲中還有Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Aureobasidium、Acinetobacter、Olivibacter等（數(shù)據(jù)未發(fā)表），與可培養(yǎng)微生物規(guī)律和優(yōu)勢(shì)菌種結(jié)論基本一致。

大曲本身作為一種選擇性培養(yǎng)基質(zhì)，對(duì)各類釀造環(huán)境微生物進(jìn)行富集篩選，形成了獨(dú)特的大曲菌群結(jié)構(gòu)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，菌種分析手段正向著新老技術(shù)聯(lián)用的方向快速發(fā)展，在彌補(bǔ)方法缺陷的同時(shí)，拓展大曲微生物的研究范圍[12]。在青稞酒釀酒微生物研究中結(jié)合新老技術(shù)，如用高通量測(cè)序等方法對(duì)青稞酒不同季節(jié)大曲中的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行更為全面、實(shí)時(shí)、精確的分析，并結(jié)合代謝組、蛋白組等的研究，分析青稞酒大曲中不同功能菌對(duì)制曲和釀酒的影響，結(jié)合傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)，篩選更多青稞酒釀造微生物，為今后功能菌的篩選及強(qiáng)化大曲提供科學(xué)依據(jù)。